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目的：本实验室前期结果表明，脑缺血可促进由Src家族酪氨酸蛋白激酶(Srcfamily protein tyrosine kinases；SrcPTKs)介导的PSD-95(postsynaptic density protein95)的酪氨酸磷酸化，其主要磷酸化位点为523位酪氨酸(Y523)。前期电生理膜片钳结果表明，PSD-95Y523磷酸化促进NMDA(N-methyl-D-aspartic)受体功能，增强了GluN1/GluN2A受体的电流。本实验采用荷包牡丹碱(bicuculline)诱导的化学性LTP(long-term potentiation)及NMDA介导的兴奋毒性模型，观察PSD-95Y523磷酸化的变化规律，研究其对GluN2A酪氨酸磷酸化的影响，以及PSD-95Y523磷酸化对SrcPTKs及其上游激酶Pyk2(proline-rich tyrosine kinase2)的调节作用，以阐明PSD-95Y523磷酸化对NMDA受体功能调控的分子机制。 方法：本研究主要采用原代培养的皮质神经元分别用荷包牡丹碱(50μmol/l)或NMDA(100μmol/l)处理不同的时间，以免疫印迹方法检测蛋白质的表达水平，免疫共沉淀方法检测PSD-95的酪氨酸磷酸化及PSD-95-Src的结合；采用Stratagene定点突变技术，构建PSD-95的Y523位模拟磷酸化突变体PSD-95(Y523D)；传代培养的HEK293细胞，通过PEI转染的方法转入重组质粒，采用免疫共沉淀方法检测蛋白质之间的相互作用，应用免疫印迹方法检测蛋白质的表达水平。 结果：1.采用原代培养的皮质神经元，以荷包牡丹碱(50μmol/l)处理后恢复不同的时间(0 min，5 min，10 min，30 min)，PSD-95酪氨酸磷酸化水平及PSD-95-Src结合明显增强，而特异性SrcPTKs的抑制剂PP2能够减少PSD-95酪氨酸磷酸化及PSD-95-Src的结合。2.原代培养的皮质神经元用NMDA(100μmol/l)刺激不同的时间(0 min，5 min，10 min，30 min)，PSD-95酪氨酸磷酸化水平及PSD-95-Src结合升高，特异性SrcPTKs的抑制剂PP2能够降低PSD-95酪氨酸磷酸化及PSD-95-Src的结合。3.HEK293细胞中共表达GluN1/GluN2A与野生型PSD-95(WT)或其去磷酸突变体PSD-95(Y523F)，经NMDA(100μmol/l)刺激10min后，采用生物素标记法检测到PSD-95(WT)能促进GluN2A亚基在细胞膜表面的表达，PSD-95(Y523F)对GluN2A亚基在细胞膜表面的表达与PSD-95(WT)结果一致。PSD-95(WT)能够能增强GluN2A的磷酸化水平，促进SrcY416磷酸化，而PSD-95(Y523F)不影响GluN2A的酪氨酸磷酸化及SrcY416磷酸化水平。PSD-95(WT)能促进Src上游激酶Pyk2Y402磷酸化水平升高，PSD-95(Y523F)不影响Src上游激酶Pyk2Y402磷酸化水平，而PSD-95(WT)组与PSD-95(Y523F)组相比，Src与GluN2A的结合水平未发生变化。4.在共表达Pyk2与野生型PSD-95(WT)或其去磷酸化突变体PSD-95(Y523F)的HEK293细胞中，PSD-95(WT)能够促进PSD-95-Pyk2的相互结合，活化的Src能促进这种结合；PSD-95(Y523F)则对PSD-95-Pyk2的相互结合没有影响。5.构建PSD-95的523位模拟磷酸化突变体PSD-95(Y523D)；共表达GluN1/GluN2A与野生型PSD-95(WT)或其模拟磷酸化突变体PSD-95(Y523F)于HEK293细胞中，NMDA(100μmol/l)刺激10min，可以检测到NMDA刺激下PSD-95(WT)能够增强GluN2A的酪氨酸磷酸化水平，同时不存在NMDA刺激下，PSD-95(Y523D)也能增强GluN2A的酪氨酸磷酸化水平。 结论：1、PSD-95酪氨酸磷酸化参与荷包牡丹碱(bicuculline)诱导的化学性LTP的调控。2、Src介导的PSD-95酪氨酸磷酸化参与了NMDA介导的兴奋毒性的调控。3、PSD-95Y523的磷酸化通过上调GluN2A的酪氨酸磷酸化调控NMDA受体亚基功能。4、PSD-95Y523的磷酸化影响PSD-95介导的PSD-95-Pyk2相互作用从而上调GluN2A的功能。因此，兴奋毒性条件下PSD-95Y523磷酸化通过影响蛋白之间的相互作用对NMDA受体的功能调控，可能成为脑缺血药物干预治疗的重要靶点。