论文部分内容阅读
目的：通过体外全骨髓贴壁法分离、培养得到纯度较高的人骨髓间充质干细胞(human bone marrowmesenchymal stem cells,hBMSCs);并使用肝病患者血清模拟体内病理微环境对hBMSCs进行向肝样细胞分化的定向诱导,并从蛋白、基因和功能水平来验证诱导后的细胞具有肝细胞的特性；从而证明了hBMSCs具有向肝细胞定向分化的潜能,同时探讨了肝损伤病理微环境对hBMSCs分化为类肝细胞的影响。
方法：(1)获取外科手术病人弃骨,采用全骨髓贴壁培养法,在体外培养、扩增出hBMSCs。(2)抽取肝功能改变明显的慢性肝炎患者全血,分离血清,并进行过滤。(3)将3～5代hBMSCs用含10％肝损伤血清的a-MEM培养基诱导培养,倒置显微镜连续观察细胞形态变化,分别于诱导后第7、14、21d对细胞进行各项指标的检测,免疫细胞化学法检测诱导后细胞甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达情况,糖原染色法检测诱导后细胞合成糖原的能力,RT-PCR法检测诱导后细胞AFPmRNA、ALBmRNA的表达水平。(4)以人胎肝细胞(L-02细胞)为阳性对照组,不加任何诱导剂的含10％FBS的a-MEM培养基培养的hBMSCs为阴性对照组。
结果：(1)原代培养的骨髓细胞大小及形态均不规则,经3～5代的传代培养,大多数贴壁的hBMSCs呈形态均一、平行状或旋涡状排列的长梭形。(2)实验组hBMSCs在诱导培养5～7d后,细胞形态出现变化,细胞两级缩短,随着诱导时间的延长,细胞两级进一步缩短,细胞多呈多边形、胞质丰富、胞核明显。阴性对照组细胞在培养的过程中形态不随着培养时间的延长而发生变化。(3)免疫细胞化学：实验组细胞诱导第7d时AFP表达较高,随着诱导时间的延长,表达下降,诱导21d基本检测不出有表达。ALB从诱导14d开始可以检测出有少量表达,随着诱导时间的延长,表达量增高,可持续至诱导后21d。阴性对照组细胞未见明显的AFP和ATB的表达。(4)PAS染色：实验组在诱导21d时进行糖原染色,可见胞浆呈红色细胞。阴性对照组细胞胞浆未见有明显的变化。(5)RT-PCR：实验组细胞第7d和第14dAFPmRNA表达呈阳性,21dAFPmRNA表达消失；ALBmRNA 14天开始表达,可持续至21d。阴性对照组细胞始终未见明显的AFPmRNA和ALBmRNA的表达。
结论:hBMSCs是具有多向分化潜能的干细胞,采用全骨髓贴壁法可以体外分离、扩增出纯度较高的hMSCs。hBMSCs一般情况下保持未分化状态,只有在特定的条件刺激下才表现为向各胚层细胞分化的特性。本实验使用了肝损伤血清在体外模拟病理微环境对hBMSCs进行诱导分化,首先证明了hBMSCs具有向肝细胞定向分化的潜能,其次证明了此病理微环境对hBMSCs向类肝细胞方向分化的重要性,为细胞移植治疗肝衰竭提供新的探索思路。