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Tα1下调IFN-γ诱导的白血病细胞IDO蛋白表达目的：胸腺肽α1(thymosin alpha-1，Tα1)是从人胸腺素中分离纯化的一种由28个氨基酸组成的小分子多肽激素，Tα1能促进体内细胞因子的分泌及淋巴细胞的作用，通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，是一种生物反应调节剂(biologicalresponse modifiers，BRMs)，可诱发T细胞表面标志的产生。吲哚胺2,3-加双氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)是一种细胞内含亚铁血红素的单体蛋白，是肝脏以外唯一催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶，而色氨酸的降解会引起T细胞的增殖受阻及凋亡增加，从而导致免疫耐受。IDO的过度表达使细胞处于色氨酸饥饿状态，在这种环境下，T细胞不能高效增殖，也无法进行克隆扩增。此外，色氨酸毒性代谢产物可以直接抑制T细胞功能，甚至诱导T细胞凋亡。本文旨在探讨胸腺肽α1对IFN-γ诱导的白血病细胞吲哚胺2,3-加双氧酶蛋白表达的影响及其机制。实验方法：WesternBlot法检测IFN/γ、Tα1/IFN-γ诱导后的白血病细胞IDO的蛋白表达。1.实验分组：①IFN-γ诱导IDO表达组②IFN-γ/Tα1联合诱导IDO表达组③阴性对照组，再对每组进行不同浓度及时间的处理。2.裂解细胞提取蛋白，并用考马斯亮蓝染色法检测细胞总蛋白。3.WesternBlot检测各组细胞的蛋白表达并用多色荧光成像仪成像，将各目的片段与相对应β-actin的像素值之比进行半定量分析。结果：1.未加入IFN-γ时，IDOmRNA图谱上可见微弱显示，IDO蛋白印迹在图谱上未见明显显示，IFN-γ诱导后，IDO蛋白印迹图谱上条带显示明显增强，诱导前后的IDO像素值进行统计分析两组间对比P<0.001,差异有显著统计学意义。2.IFN-γ诱导后，加入Tα1作用，IDO蛋白条带随着Tα1浓度的增强及和作用时间的增长明显减弱。Tα1浓度为0.2ug/ml时，Tα1对HL-60细胞IDO的抑制率为39.92%,对K562细胞IDO的抑制率为20.59%；Tα1浓度为5ug/ml时，对HL-60细胞IDO的抑制率为80.24%,对K562细胞IDO的抑制率为61.76%。对不同浓度Tα1诱导后的IDO蛋白像素值进行统计分析，组间差异有统计学意义(HL-60为F=4187.76P<0.001, K562为F=59.497P<0.001);时间组组间差异有统计学意义（P<0.05）。3.当IFN-γ/Tα1同时作用于HL-60与K562细胞后，IDO蛋白条带同样随着Tα1浓度的增强及和作用时间的增长明显减弱，提示Tα1能够削弱IFN-γ对IDO的诱导作用，表达降低。统计结果:浓度组HL-60为(F=117.7P<0.001),K562为(F=1382.67P<0.001)有统计学意义；时间组组间差异P<0.05，有统计学意义。结论：1.一般情况下，IDO在白血病细胞中呈现低水平表达。2.IFN-γ能显著上调白血病细胞IDO蛋白表达。加入IFN-γ后，IDO表达明显增强，提示IFN-γ的运用可能会促进肿瘤细胞的免疫逃逸，从而导致肿瘤细胞的大量增长，因此在IFN-γ用于白血病患者的治疗时，应警惕其对免疫耐受机制形成的促进作用。3.Tα1对IFN-γ诱导后的白血病细胞IDO蛋白的表达呈时间依赖性和浓度依赖性下调。4.Tα1抑制IDO蛋白表达。IFN-γ/Tα1同时作用于HL-60与K562细胞后，IDO蛋白表达明显减弱，提示Tα1能够削弱IFN-γ对IDO的诱导作用，使其表达受到抑制。Tα1下调IDO+白血病细胞对T细胞增殖的影响目的：研究Tα1下调IDO+白血病细胞对T细胞的抑制作用及其机制。实验方法：MTT法检测IDO+白血病细胞对T淋巴细胞抑制率。1.IFN-γ诱导HL-60及K562细胞：IFN-γ（1000IU/ml)诱导HL-60及K562细胞72小时。2.HL-60及K562细胞与PBL(外周血淋巴细胞)混合培养：实验分为①Hγ/kγ-MlR-PHA组；②Hγ/kγ-MlR-PHA+Tα1组；③Hγ/kγ-MlR-PHA+1-MT组，分别对3组进行药物诱导72小时。3.MTT法检测T淋巴细胞抑制率：与MTT反应4小时后结束培养，加入二甲基亚砜溶解。4.酶联免疫检测仪570nm检测OD值并分析数据。实验结果：1.PHA对HL-60/K562细胞形状及数量的增长都无明显影响。2.PHA能促进T淋巴细胞的增殖及分化。电镜下观察PHA诱导后的淋巴细胞数量增多，体积增大。3.数据分析：Hγ/kγ-MlR-PHA组较Hγ/kγ-MlR-PHA+Tα1组与Hγ/kγ-MlR-PHA+1-MT组对T淋巴细胞的抑制作用更加明显，生长率降低。3组药物分别对细胞诱导后，当T/HL-60:1:20时F=72.647,P<0.001，两组之间对比P<0.01,有统计学意义；T/HL-60:1:50时F=38.141,P<0.001，有统计学意义。结论：1.PHA能促进T淋巴细胞的增殖分化，PHA诱导后可见T淋巴细胞数量增多，体积增大，有较大集落形成，形成淋巴母细胞群。2.Tα1下调IDO对T淋巴细胞的抑制作用。PHA诱导后，T淋巴细胞大量增殖，加入白血病细胞后，T淋巴细胞增殖受到抑制，而分别加入Tα1与1-MT后，T淋巴细胞抑制率降低，提示Tα1可能同1-MT一样能够通过下调或抑制白血病细胞IDO表达来降低对T淋巴细胞的抑制作用。