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近年来微藻以其生长周期短、光合作用强、不占用农业耕地等竞争性优势进入能源研究的主流。然而,淡水资源的过量消耗、油脂产率不理想、微藻收获和油脂提取能耗高等因素限制了微藻生物柴油生产的规模化进程。寻求廉价培养基、淡水替代品、油脂含量高且易收获和油脂易提取的藻株对生物能源发展至关重要。利用海洋微藻可有效降低生物能源生产的淡水投入,然而现已分离的可培养海水藻种类较少,生长速率和油脂含量普遍较低,与之不同的是,可培养的淡水藻藻源丰富,且一定的盐度是提高淡水藻脂质积累的有效刺激手段。因此利用储量丰富的海水培养淡水藻有望成为微藻生物能源领域的新突破点。因此,本课题从降低微藻生物柴油的生产成本出发,利用海水代替微藻培养基中的淡水资源,通过添加不同比例的餐厨垃圾厌氧消化液(0、1、3、5、8和1 5%)培养淡水小球藻SDEC-18,建立了利用海水培养淡水藻的环境-经济友好型新工艺:研究海水中的盐度对淡水藻生长和油脂积累的影响,从生理生态及分子生物学层面阐明其耐盐机制;通过追踪淡水藻细胞内淀粉、油脂的含量变化,探明海水盐度刺激下淡水藻的油脂合成机制;建立淡水藻的沉降效率与沉降时间的动力学关系,解析海水盐度刺激下淡水藻的沉降性能及胞外聚合物释放规律;明确海水中的盐度对淡水藻细胞破碎及油脂提取的影响,揭示淡水藻在盐胁迫下的细胞壁脆性及细胞壁结构组分的响应机制。以期实现微藻低成本培养、高效积累油脂、细胞易收获和油脂易提取的有机统一。主要研究结果如下:(1)海水中的盐度对淡水小球藻生长、油脂积累、细胞形态和细胞膜通透性、光合色素以及脂肪酸组分的影响。在海水+0%消化液(S+0%)中由于海水盐度高且氮磷等营养物质缺乏,小球藻几乎没有生长,而在S+3%和S+5%培养基中由于消化液提供的营养物质充足,小球藻的生长比较理想,生物量分别可以达到0.259和0.284 g/L,最终细胞个数可以达到6.83 × 108和7.17 × 108个/L,平均生物质产率可以达到22.8和25.3 mg/L/d,几乎可以达到在BG11培养基中的生长水平。油脂积累方面,在含有海水的培养基中,油脂积累显著,在第10天S+0%培养基中小球藻由于受到盐胁迫和营养胁迫双重胁迫油脂含量可以达到61.8%,是BG11培养基中的2倍。在S+3%和S+5%培养基中,小球藻的油脂产率可以达到15 mg/L/d,是BG11培养基中油脂产率的1.4倍。由于盐度可以抑制细胞分裂,为细胞尺寸的增加赢得了时间,因此在含有海水的培养基中的小球藻细胞尺寸普遍比BG11中大,尤其是在S+3%培养基中,细胞的最大直径可以达到14.56 μm。同时,海水会使微藻细胞表面发生褶皱,从而增大细胞比表面积,有利于养分的吸收。此外,在含有海水的培养基中小球藻细胞膜受到损伤,细胞的通透性增加。叶绿素a/叶绿素b的值降低,类胡萝卜素/叶绿素的值增加表明小球藻在含有海水的培养基中受到盐胁迫产生活性氧自由基,此时小球藻积累比BG11中高出2-4倍的类胡萝卜素来启动自我保护机制,这是因为类胡萝卜素具有共轭双键,可以接受来自活性物质的电子,中和自由基。(2)盐胁迫下低淀粉含量的淡水小球藻细胞内淀粉、脂质和蛋白的含量变化。在BG11培养基中,油脂含量和淀粉含量在整个培养过程中变化不大,而在S+5%、S+8%和S+1 5%培养基中,淀粉含量在前4天有缓慢的增加,油脂含量几乎不变,从第4天之后淀粉迅速降低,相应地,油脂含量从第4天有了明显的增加,这主要是因为碳流从淀粉向油脂发生了转化。然而在S+0%、S+1%和S+3%培养基中,随着海水比例的增加,淀粉含量从第2天开始显著降低,相应地,油脂含量也从第2天开始迅速积累,证实了盐度确实能促进淀粉向油脂的转化。在含有海水的培养基中,观察到从第6天到第10天,淡水小球藻中淀粉颗粒减少,油脂颗粒明显增加,而且利用透射电镜技术独特地发现了淀粉和油脂颗粒的重叠结构,进一步说明淀粉可以向脂质发生转化;此外,在BG11和S+1 5%的培养基中有蛋白核存在,而在高盐度的S+0%和S+5%培养基中没有明显的蛋白核,说明在盐胁迫下,碳流发生了重新分配流向了脂质,而不是淀粉和蛋白。目前,盐胁迫下低淀粉含量的淡水藻细胞内淀粉向脂质转化的研究尚未见报道,本研究利用脂质/淀粉的含量测定、染色进行显微观察、透射电镜技术再结合代谢分析展现了一套盐胁迫下低淀粉含量的淡水藻细胞内油脂合成的调控网络,证明了碳流重新分配和淀粉向脂质的碳流转化两种油脂机制在盐胁迫的低淀粉含量的淡水藻中共存。(3)海水中的盐度对淡水小球藻细胞沉降、胞外聚合物的产生、细胞增大的影响。在BG11培养基中,小球藻的沉降速率一直比较低,沉降2h后,沉降效率只能达到50%。而在S+0%、S+5%和S+1 5%的培养基中培养的小球藻在初始时间就迅速沉降,沉降效率在2 h内可以达到90%,这主要是因为海水中的盐度刺激了小球藻胞外聚合物(EPS)的产生,有利于微藻自絮凝:在含有海水的培养基中培养的小球藻产生的EPS量为0.77-1.1(Ui,n×106),是在BG11培养基中产生量的8-12倍。通过镧固定透射电镜技术建立了观察微藻胞外聚合物(EPS)的新方法,发现在含有海水的培养基中培养的小球藻产生的EPS比较密集,而在BG11中的小球藻表面几乎观察不到EPS。此外,海水中丰富的金属离子与EPS的协同作用也能促进微藻自絮凝:在BG11培养基中的Ca2+和Mg2+的初始浓度只有9 mg/L和7 mg/L,在第10天之后,BG11培养基中仍然有少量的Ca2+和Mg2+存在,然而在含有海水的培养基中,小球藻在培养前和培养后培养基中的Ca2+和Mg2+的浓度差距达到了500 mg/L和100 mg/L,表明有大量的Ca2+和Mg2+在与EPS的相互作用中被消耗掉。除了 EPS和金属离子,细胞增大也有利于细胞沉降:在含有海水的培养基中,较大的细胞占了绝大部分,尤其是在S+5%培养基中,细胞的平均直径可以达到8.65μm,要远远大于在BG11中的细胞直径(5.72 μm)。(4)海水中的盐度对小球藻细胞破碎、油脂提取效率以及细胞壁组分的影响。通过超声破碎仪对藻细胞进行30 min的超声处理,发现在BG11培养基中生长的小球藻的细胞破碎率只有35%,而在含有海水的培养基中却能达到75-80%,比BG11培养基高出2倍多,这主要是因为海水中的盐度会改变微藻结构的完整性和细胞壁的组分,降低了细胞壁的机械强度,从而更容易破碎。在油脂提取方面,BG11中藻细胞脂质提取完全至少需要连续提取3次,超声处理消耗的能量超过47500 kWh/Kg;而在S+0%、S+5%和S+1 5%培养基中培养的小球藻,经过2次提取就能把油脂提取完全,这主要是因为含有海水的培养基中培养的小球藻更易破碎,从而有机溶剂更易进入微藻细胞,更有利于油脂的提取。利用免疫荧光技术观察到了微藻细胞内的微管,发现在含有海水的培养基中的淡水小球藻的微管易破碎,导致纤维素合成酶从细胞膜脱落,进而纤维素合成受阻:BG11中小球藻的纤维素含量在整个培养过程中都比较高,然而在含有海水的培养基中,纤维素含量明显降低,在第10天S+0%、S+5%和S+1 5%培养基中小球藻的纤维素含量只有6.43%、6.22%和5.92%,只占BG11培养基中的一半。因此,利用海水培养淡水藻工艺是可行的,缓解了淡水资源的消耗,为微藻的大规模培养开辟了新的途径;实现了淡水藻的高效油脂积累,对于采用代谢工程手段提高工业微藻的油脂产量提供了重要的理论基础和新的研究思路;节约了微藻收获和油脂提取的成本,推进了微藻生物柴油的商业化进程。