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子痫前期(pre-eclampsiaon,PE)是妊娠期特有的一种多系统进展性疾病,其特点是妊娠20周后新发高血压和蛋白尿,或出现新发高血压和终末器官功能障碍伴或不伴蛋白尿。发生率约4-6%,根据发病时间(以34周为界)分为早发型子痫前期和晚发型子痫前期。<34周发病者为早发型子痫前期即为重型子痫前期。目前认为PE是由多种因素引起的,包括螺旋动脉重塑,胎盘氧化应激,内皮功能障碍和全身性炎症。无论起始原因如何,已知胎盘在PE的发生和发展中起关键作用,去除胎盘会导致PE的临床症状停止。因此,对阐述PE发病机制最重要的是要了解在PE期间基因调控机制如何在胎盘内发挥作用。近年来,microRNAs(miRNAs),一种长度约为19-25nt的非编码RNA,作为一类新的基因表达调控因子而备受关注。miRNA可以调节参与正常发育和疾病发作的各种细胞过程,包括细胞周期、发育、代谢、各种免疫应答等多个过程,参与人体多种疾病的发生发展,如:发育障碍、肿瘤、阿尔兹海默症和PE等。有多个研究表明PE患者胎盘中miRNA表达明显异常,多种差异表达的miRNA在PE发生发展中发挥重要作用。miR-133基因在许多人类疾病中失调,包括膀胱癌,肺癌,胃癌,垂体肿瘤和各种心血管疾病。目前尚无关于miR-133在PE患者外周血及滋养细胞中的表达及相关功能研究。本课题拟研究miRNA-133在子痫前期的表达情况、生物学功能以及可能的作用机制。第一部分 miR-133在早发型子病前期中的表达及其生物学功能研究目的:旨在研究miRNA133在早发型子痫前期患者外周血及胎盘来源的原代滋养层细胞中的表达情况,以及探讨其可能的生物学功能。方法:入组早发型子痫前期患者(PE组)和正常妊娠患者(NC组),测量其血压、24小时尿蛋白及肝功能和肾功能。RT-PCR检测PE组和NC组外周血中miR133的表达情况。密度梯度离心法从胎盘组织分离滋养层细胞。构建miR-133 Mimics和inhibitors,过表达或敲除miR-133的表达。ELISA法检测转染前后细胞因子的变化。TUNEL法检测转染前后滋养细胞凋亡情况。结果:1.早发型子痫前期患者(PE组)收缩压(146.8±2.4mmHg VS 112.5 ±3.8mmHg)、舒张压(108±4.3 mmHg VS 75.8±3.9mmHg)和 24 小时尿蛋白(7.25±0.42gVS 0.01g)明显高于正常对照组,同时PE患者肝肾功能明显异常。2.miR-133在早发型子痫前期(PE组)患者外周血中表达明显升高。3.过表达miR-133后炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1)产生增加,而敲除miR-133后炎症因子产生减少。4.过表达miR-133后滋养层细胞凋亡明显增加,而敲除miR-133后滋养层细胞凋亡明显减少。第二部分miR-133促滋养细胞凋亡相关机制研究目的:探讨miR-133促滋养细胞凋亡的相关机制。方法:构建 miR-133 Mimics 和 inhibitors,过表达或敲除 miR-133 的表达。RT-PCR检测促凋亡相关基因Caspase-3及抑制凋亡相关基因BCL-2和RHO\ROCK信号通路相关基因的表达情况。Western blotting验证相关基因的蛋白表达情况。结果:1.过表达miR-133后促凋亡基因Caspase-3在RNA水平高表达而抑制凋亡基因BCL-2低表达,敲低miR-133后促凋亡基因Caspase3低表达,而抑制凋亡基因BCL-2的表达水平升高。Rho/ROCK通路相关蛋白ROCKI在Mimics组高表达,而在,Inhibitors组ROCKI低表达。2.过表达miR-133后促凋亡基因Caspase-3和Rho/ROCK通路相关蛋白ROCKI在蛋白水平高表达,敲低miR-133后低表达。提示miR-133可能通过Rho\ROCK信号通路调控滋养层细胞凋亡。结论:1.与正常孕妇相比,miR-133在早发型子痫患者外周血中表达明显升高。因此miR-133可能作为PE诊断的新标记物。2.在原代滋养层细胞中过表达miR-133后促进炎症因子产生和滋养层细胞凋亡,敲除后抑制炎症因子产生和滋养层细胞凋亡。此外,过表达miR-133后促凋亡基因Caspase-3在RNA和蛋白水平高表达而抑制凋亡基因BCL-2低表达,敲除miR-133后观察到相反的现象。这表明miR-133通过调控滋养细胞凋亡在PE发生中发挥作用。3.过表达miR-133后Rho/ROCK通路相关蛋白ROCKI在RNA和蛋白水平高表达,敲除miR-133后ROCKI在RNA和蛋白水平低表达。这表明miR-133可能通过激活Rho/ROCK信号通路而调控滋养层细胞凋亡,在早发型子痫前期中发挥重要作用。