论文部分内容阅读
养鸭业在我国农业经济结构中占有重要地位,随着养殖业的发展,以农村散养传统养鸭模式逐渐转变为集约化养殖。由于集约化养鸭养殖密度大,规模鸭场环境卫生不达标、水污不能分离、粪污依靠自然沉淀降解、鸭舍场地潮湿和通风不良等因素易导致细菌性疾病多发,一旦发生疫病将给养殖场带来巨大的经济损失。为防控细菌性疾病养鸭场通常会使用大量消毒剂来进行环境消毒,选择消毒剂类型单一并重复使用,不仅造成环境污染,也会导致细菌极易产生耐药性,从而降低消毒剂的杀菌效果。本研究对贵州省某舍饲鸭场环境(空气、粪便、垫料及饮水)进行菌落总数测定,并采用16S r DNA高通量测序方法对粪便、垫料及饮水进行微生物多样性及丰度分析,掌握舍饲鸭场环境微生物的结构与组成;选用市场上销售的五种消毒剂(聚维酮碘、苯扎溴铵、月苄三甲氯铵、复方戊二醛、戊二醛癸甲溴铵)对鸭场五种常见细菌(大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌)进行最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)的测定;并设计15对消毒剂耐药相关基因的特异性引物,通过PCR扩增相关基因片段,分析这5种病原菌携带耐消毒剂基因情况,掌握细菌对消毒剂的抗性。运用五种消毒剂对鸭场进行现场消毒试验及消毒效果分析,研究结果为养鸭场消毒规程的制定和消毒措施的执行提供参考。1.贵州省某舍饲鸭场环境微生物的检测与分析为了解鸭场微生物的多样性及丰度,采集鸭场空气、粪便、垫料及饮水进行菌落总数测定,针对细菌16S r DNA基因V4～V5高变区设计特异性引物,对采集鸭场粪便、垫料及饮水样品进行PCR扩增及测序。结果:空气菌落总数为3.79×10~4CFU/m~3,粪便菌落总数为2.67×10~7CFU/g,垫料菌落总数为3.7×10~6CFU/g,饮水菌落总数为12 CFU/m L。基于16S r DNA高通量测序结果:鸭场粪便、垫料及饮水9个样品共获得有效序列总数为406145,优化序列的总数为336727,平均测序读长在319～529 bp之间;在97%的相似度水平下共产生有效OTUs个数为4375,共有的数量为24;群落组成结构中有41门、44纲、82目、137科、311属、250种的菌群被鉴定;在细菌属水平,检测出里氏杆菌属、埃希菌属、沙门菌属、链球菌属、葡萄球菌属等潜在动物病原菌。2.五种消毒剂对鸭场常见细菌的杀菌效果及消毒剂耐药基因检测与分析选用五种消毒剂(聚维酮碘、苯扎溴铵、月苄三甲氯铵、复方戊二醛、戊二醛癸甲溴铵),对鸭场分离出的五种常见细菌(大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌)进行最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定,并配制这五种消毒剂的最小杀菌浓度对大肠杆菌进行悬液定量杀菌试验,观察这五种消毒剂对大肠杆菌的杀菌最短作用时间。设计15对消毒剂耐药基因(ade G、ade J、fab I、amv A、ade T1、ade T2、abe D、abe M、ade B、car O、qac E?1、qac A/B、qac C、qac G、qac J)特异性引物,通过PCR扩增分析这5种病原菌携带耐消毒剂基因情况。结果:聚维酮碘对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的MICs/MBCs均为1:4,对鸭疫里默氏杆菌及巴氏杆菌的MICs/MBCs均为1:8;苯扎溴铵对这5种病原菌的MICs/MBCs分别为1:200、1:25;月苄三甲氯铵对这5种病原菌的MICs/MBCs分别为1:1920、1:960;复方戊二醛对这5种病原菌的MICs/MBCs分别为1:1200、1:600;戊二醛癸甲溴铵对这5种病原菌的MICs/MBCs分别为1:1000、1:500。复方戊二醛在MBC下作用1 min可对大肠杆菌的杀灭率达100%;聚维酮碘、月苄三甲氯铵、戊二醛癸甲溴铵在MBC下作用3 min可对大肠杆菌的杀灭率达100%;苯扎溴铵在MBC下作用5 min可对大肠杆菌的杀灭率达100%。在1株大肠杆菌、1株葡萄球菌、1株鸭疫里默氏杆菌中检测出耐消毒剂基因qac E?1,阳性率为30%(3/10),其他14种耐消毒剂基因未检测出。3.五种消毒剂对鸭场进行现场消毒试验分别配制最小杀菌浓度的苯扎溴铵、月卞三甲氯铵、复方戊二醛及戊二醛癸甲溴铵4种消毒剂,采用雾线、喷洒消毒方法对舍饲鸭场空气、漏缝地板、料槽、蛋框及运输车车轮进行现场消毒,配制最小杀菌浓度的聚维酮碘,对鸭子脚部皮肤进行涂抹消毒,测定这五种消毒剂消毒前后的菌落总数变化,计算这5种消毒剂对细菌的消亡率。结果:戊二醛癸甲溴铵对鸭舍空气细菌消亡率最高,为34.85%;复方戊二醛对漏缝地板细菌消亡率最高,为96.78%;戊二醛癸甲溴铵对料槽细菌消亡率最高,为74.35%;复方戊二醛对蛋框细菌消亡率最高,为81.31%;复方戊二醛对运输车车轮细菌消亡率最高,为87.5%;聚维酮碘对鸭子脚部皮肤细菌的消亡率为72.45%。结论:1.鸭场中空气细菌菌落数为3.79×10~4CFU/m~3,超出NY/T 388-1999畜禽场环境质量标准限值(25000 CFU/m~3);饮水菌落总数为12 CFU/m L,符合GB 5749—2006生活饮用水卫生标准(100 CFU/m L);粪便菌落总数为2.67×10~7CFU/g,超出国标关于粪便处理标准(1×10~6CFU/g);垫料菌落总数为3.7×10~6CFU/g,超出了国标规定的清洁土壤数值(1×10~4CFU/g)。2.基于16S r DNA高通量测序成功地检测了鸭场(粪便、垫料及饮水)细菌群落结构的多样性,获得了全面且深入的菌群信息。9个样品共获得有效序列总数为406145,优化序列的总数为336727,平均测序读长在319～529 bp之间;在97%的相似度水平下共产生有效OTUs个数为4375,涵盖了41门、44纲、82目、137科、311属、250种的细菌菌群。3.聚维酮碘溶液在稀释比为1:4,至少作用3 min可表现出较好杀菌效果;苯扎溴铵溶液在稀释比为1:25,至少作用5 min可表现出较好杀菌效果;月苄三甲氯铵溶液在稀释比为1:960,至少作用3 min可表现出较好杀菌效果;复方戊二醛溶液在稀释比为1:600,至少作用1 min可表现出较好杀菌效果;戊二醛癸甲溴铵溶液在稀释比为1:500,至少作用3 min可表现出较好杀菌效果。4.在大肠杆菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌中均检测出qac E?1耐消毒剂基因,且阳性率为30%(3/10)。5.通过配制最小杀菌浓度的五种消毒剂对鸭场进行现场消毒试验中,复方戊二醛对漏缝地板、蛋框、运输车车轮的细菌消亡率最高,戊二醛癸甲溴铵对鸭舍空气、料槽的细菌消亡率最高,聚维酮碘对鸭子脚部的细菌的杀灭效果良好。