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鹅细小病毒是细小病毒科、细小病毒属的成员，主要感染1月龄内雏鹅和雏番鸭，以急性肠炎及肝、肾、心实质脏器炎症为特征的烈性传染病。该病危害程度与日龄密切相关，10日龄内雏鹅发病率和死亡率可达100％。在易感群中的致死率高达70％，以后发病日龄随日龄增大而逐渐减少。但近几年有报道称该病的发病日龄有增大的趋势，超过30日龄的占14.3％，而且发病症状也变得不典型。这可能与鹅细小病毒毒力增强和基因变异有关。自1956年我国学者方定一首次发现并分离到病毒至今，国内外一直有分离到该病毒的报道，说明该病已经呈世界范围流行，对养鹅业威胁很大。本试验旨在建立一种快速、特异、准确的诊断GPV的荧光定量PCR(SYBRGreen I real-time PCR)方法，为指导临床诊断样品的采集保证诊断的可靠性与准确性和对该病的诊断监测提供重要的理论依据。此外，还分别将来自广东省内的5株GPV毒株和l株MDPV毒株，通过PCR技术扩增出其全基因序列并进行序列分析和比较，为今后研究该病的分子生物学特性及开发有效的免疫制剂提供科学依据。
本研究共分四部分：
一、GPV广东株的分离鉴定
采取2008年送检番鸭和2005年本实验室保存病料的心脏、肝脏、肠道等组织脏器，制成乳剂，接种于10日龄番鸭胚尿囊腔，结果在接种后72～144h内，番鸭胚出现死亡，死亡率90％，且番鸭胚呈出血状；接种2日龄雏番鸭，结果表明试验组雏番鸭能够表现出小鹅瘟临床症状，而对照组正常；琼脂扩散试验结果显示与鹅细小病毒血清有明显沉淀线；参照GenBank GPV标准株B株结构蛋白VP1基因序列设计一对特异性引物，PCR反应扩增获得目的条带，克隆测序后，与GPVB株序列相似性达97.9％，推导氨基酸相似性96.9％。综合以上生物学和分子生物学的实验结果，可确定分离到2株GPV，并命名为GD0801株和GD0802株。
二、鹅细小病毒VP蛋白部分基因的克隆
该研究的目的是克隆出含扩增片段的质粒，并比较该病毒与已发表序列的相似性。提取鹅细小病毒DNA作为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增，结果只有以GPV为模板才可以扩增出407bp的特异条带。纯化产物与pMD-T Vector连接，连接产物转化感受态细胞DH5a，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后，进行测序。结果表明该GPV毒株的VP蛋白基因序列与Genbank公布的序列有98.3％的相似性。该克隆成功为荧光定量PCR检测标准曲线的绘制提供了阳性质粒。
三、GPV SYBR GREEN荧光定量PCR检测方法的建立
根据国际GenBank1995年发布的鹅细小病毒(GPV)B株的全基因组序列，针对GPV的保守基因片段VP设计一对特异性引物，建立了一种用于检测GPV的特异的GPV SYBR GREEN方法，该方法能够特异地扩增出预期大小约为134bp特征性片段。特异性实验证明，该法对鸭瘟病毒(DPV)、鹅源新城疫病毒和鹅流感病毒及正常鹅组织DNA均呈阴性反应；灵敏性实验证明，该方法能够检出GPV基因质粒达103个拷贝数。
四、鹅细小病毒和番鸭细小病毒全基因序列的克隆和序列分析
本研究根据国外已发表的GPV和MDPV基因序列，设计并合成了两对兼并引物，两对引物扩增长度覆盖全长的NS基因和VP基因，扩增长度分别为1997bp和2325bp。克隆序列测定，拼接后，得到5株GPV和1株MDPV分离株的非结构基因和结构基因。与国内外部分发表的毒株的对应序列比较，同时与番鸭细小病毒(Muscovy Duckparvovims，MDPV)比较，结果表明：本研究的5株GPV和1株MDPV的NS基因长度全部为1884bp，编码627个氨基酸，有4个糖基化位点；编码的氨基酸序列中都含有保守“P环”结构域，即GPATTGKT序列，这是GPV NS1中最保守的序列；结构基因VP长为2199bp，编码732个氨基酸；5个糖基化位点全部位于结构基因的VP3片段；分离的5株毒株均符合强毒株的分子特征，即在VP3基因的797位G，1141位A，1144位G，1169位C，1185位T。进化树分析表明，5株GPV与国内外的GPV毒株均表现出较高的相似性，并且具有共同的分子特征；且与番鸭细小病毒的亲缘关系比较接近。