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目的:观察小鼠结膜下注射编码人类vasohibin-1蛋白的重组腺病毒后,该蛋白对碱烧伤诱导的角膜新生血管(cornea-1 neovascularization,CNV)的作用。
方法:110只balb/c小鼠随机分成两组。治疗组小鼠结膜下注射5ul109pfu编码人类vasohibin-1蛋白的复制缺陷型腺病毒(Ad-Vasohibin-1)。对照组小鼠结膜下注射5ul109pfu腺病毒空载体(AdNull)。空白对照组10只,不进行任何处理。结膜下注射5天后,所有小鼠右眼角膜中央采用2.5ul0.1 N NaOH烧灼30秒,诱导角膜新生血管模型。碱烧伤后观察9天,每3天观察角膜新生血管生长情况,并照相,计算新生血管占全角膜的比值。分别在以上3个时间观察点每组取3只小鼠行免疫荧光检测,并分别在碱烧伤前、碱烧伤后3天和9天分别每组取10只小鼠行western blotting检测,观察人类vasohibin-1蛋白在角膜组织中的表达情况。观察期末,运用实时定量逆转录酶链式反应法分析两组小鼠角膜组织VEGF、及其受体VEGFR1和VEGFR2,以及内源性vasohibin-1的基因表达异同。
结果:碱烧伤后3、6和9天,治疗组角膜新生血管面积比分别为7.11％±3.91％、31.64％±4.71％和45.02％±9.98％,对照组分别为15.48％±1.79％、43.93％±6.15％和66.24％±7.17％。与对照组相比,结膜下注射Ad-Vasohibin-1的治疗组角膜新生血管在碱烧伤后的每个观察点明显减少(均P=0.000)。碱烧伤后3天,vasohibin-1蛋白明显表达于上皮下基质内,高度集中在新生血管区域。有的vasohibin-1蛋白散在分布于角膜中央的基质浅层和深层,而非集中在新生血管区。相比,结膜下注射AdNull组的小鼠角膜及正常角膜不表达人类vasohibin-1蛋白。结膜下注射Ad-Vasohibin-15天后,碱烧伤前,westernblotting检测到角膜组织表达人类vasohibin-1蛋白,碱烧伤后3天达到高峰,一直持续高表达至碱烧伤后9天。而空载体组及正常对照组不表达。治疗组VEGFR2和内源性vasohibin-1的基因表达水平显著低于对照组(t1=-2.161,P1=0.047；t2=-2.236,P2=0.041)。两组相比,VEGF和VEGFR1的基因表达水平没有显著差异(均P>0.05)。
结论:结膜下注射编码人类vasohibin-1基因的重组腺病毒显著减少碱烧伤诱导的角膜新生血管。其功能受下调VEGFR2的表达调控。