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在肝切除或肝移植过程中,术前合并高血糖严重恶化了肝脏的缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI),降低该部分患者的预后,但其作用的确切机制目前未得到明确阐述。本课题组前期的研究结果表明内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)在肝脏IRI过程发挥着至关重要性作用。在本项研究中,我们陈述了高血糖是否以及如何诱导ERS,从而影响肝脏IRI。本研究招募了肝脏良性疾病实行肝切除术并且具备良好肝脏功能的糖尿病病人,并使用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的高血糖小鼠和正常小鼠分别建立肝脏IRI模型。在体外用高糖和低糖培养基分别培养骨髓来源的巨噬细胞。结果显示在合并糖尿病的肝切除患者肝组织和链脲佐菌素制备的高血糖小鼠肝组织中,ERS信号通路中的ATF6-CHOP轴在肝脏组织和枯否细胞(Kupffer cells,KCs)中被特异性地激活。高血糖小鼠术前注射ERS信号通路抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,PBA)显著地减轻高血糖恶化的肝脏IRI。进一步研究表明CHOP基因敲除显著地缓解高血糖加重的肝脏IRI和炎症反应。此外,作为炎症反应的抑制因子β-catenin蛋白在高血糖小鼠中伴随ATF6-CHOP信号通路的激活被有效抑制,使用PBA预处理高血糖小鼠或CHOP基因敲除后显著提升高血糖抑制的热缺血肝脏组织中β-catenin表达水平。靶向作用于肝脏KCs细胞的β-catenin小分子干扰RNA终止了CHOP基因敲除的保护效应,加重了高糖恶化的肝脏IRI。体外实验研究表明高糖特异性激活了ERS-ATF6-CHOP信号通路,并抑制β-catenin表达,从而加重骨髓来源巨噬细胞中TLR4介导的炎症反应。采用PBA预处理高糖培养的巨噬细胞或者在高糖培养的巨噬细胞中干扰CHOP表达能够有效地抑制炎症反应。本研究首次证实了高血糖特异性激活KCs细胞内质网应激ATF6-CHOP信号通路,抑制β-catenin蛋白表达,促进炎症反应从而恶化肝脏IRI。这有可能为临床高血糖或糖尿病相关肝脏IRI的防治提供新型治疗策略和理论依据。第一部分体内研究高血糖激活内质网应激ATF6-CHOP轴调控β-catenin信号通路在肝脏IRI中的作用STZ腹腔注射构建稳定的高血糖小鼠模型,发现高血糖特异性地激活肝脏组织和KCs细胞中的ATF6-CHOP信号通路。在高血糖小鼠和腹腔注射PBA预处理的高血糖小鼠上分别建立90分钟缺血70%肝脏IRI模型,分别在恢复血流后0h,6h和24h检测肝脏损伤程度及炎症反应情况。在阻断相同时间的肝脏血流后,在复流后的0h和6h,PBA预处理显著降低血清中ALT和AST的水平,减轻了肝脏组织的结构损伤及细胞凋亡,抑制了炎症基因的表达及巨噬细胞、中性粒细胞的浸润;复流后24h未发现两组存在显著性差异。在野生型小鼠和CHOP基因敲除小鼠上分别建立高血糖模型,然后建立70%肝脏缺血90分钟再灌注后6h模型。与野生型高血糖小鼠相比,CHOP基因敲除的高血糖小鼠血清中ALT和AST含量减少,CHOP基因敲除明显减轻肝脏组织结构破坏,抑制细胞凋亡。缺血性肝组织中促炎症基因表达水平降低,血清中促炎症因子分泌减少,巨噬细胞和中性粒细胞在肝脏组织中浸润显著减少。β-catenin,作为炎症反应的负性调控因子,伴随着高血糖激活ATF6-CHOP通路而被有效地抑制,CHOP基因敲除后β-catenin表达水平显著升高。为明确高血糖激活ATF6-CHOP轴调控β-catenin对肝脏IRI的影响,本研究采用一种si RNA巨噬细胞靶向性干扰技术方法,将β-catenin si RNA输送到CHOP基因敲除高血糖小鼠肝脏KCs细胞,建立肝脏IRI模型。结果显示β-catenin si RNA能显著增加肝脏IRI促炎症基因表达及分泌,抑制抗炎症基因表达及分泌,恶化肝脏IRI。第二部分体外研究高糖特异性激活巨噬细胞ATF6-CHOP轴调控β-catenin信号通路的作用机制将骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)分别采用高糖(30m M)和低糖(5m M)培养,连续培养7天后,分析内质网应激通路分子IRE1α、XBP1、ATF4、PERK、CHOP和ATF6表达水平。结果显示,高糖特异性地激活巨噬细胞ATF6-CHOP信号通路。用高糖培养基培养小鼠BMDMs 7天,一部分细胞采用PBA预处理12h,然后添加LPS(1ug/ml)刺激,并于刺激后的0h,2h,6h,12h和24h收集培养细胞上清及蛋白。结果表明,与未处理组高糖培养的BMDMs相比,PBA预处理抑制促炎症因子TNF-α和IL-6(6,12和24h)的分泌,促进抗炎因子IL-10(6和12h)的分泌。未添加PBA预处理的高糖培养BMDMs,β-catenin蛋白表达水平在2h和6h之间迅速地降低,然后在12h和24h之间逐渐恢复。PBA预处理可稳定β-catenin的表达水平。而且,PBA预处理明显升高p-Akt蛋白表达水平。NF-κB p65蛋白表达水平在PBA预处理后显著降低。体外高糖培养BMDMs后通过si RNA干扰技术,抑制CHOP表达后β-catenin表达显著增加,导致促炎症基因的表达及分泌水平降低,抗炎症基因IL-10的表达及分泌水平增加。高糖培养CHOP基因敲除的BMDMs,一部分细胞采用si RNA干扰技术抑制β-catenin表达,同时野生型BMDMs也分别采用低糖和高糖培养基培养,然后添加LPS刺激24h。CHOP基因敲除降低高糖增加的促炎症基因表达和分泌,增加高糖抑制的抗炎症因子IL-10表达和分泌。β-catenin si RNA终止了CHOP基因敲除后的抗炎功能。在上述培养细胞中分析p-Akt和NF-κB p65蛋白表达水平。结果显示高糖处理后NF-κB p65表达增加,p-Akt被明显抑制。而CHOP敲除后,Akt磷酸化水平明显升高,NF-κB p65表达水平显著降低。在CHOP基因敲除BMDMs中干扰β-catenin表达后,p-Akt表达水平显著降低,而NF-κB p65明显活化。