【摘 要】
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目的:肺炎链球菌是呼吸道的正常定植菌,但可以通过侵入粘膜屏障引起多种疾病,疫苗是预防其感染的一种有效手段。本课题组前期的研究发现融合蛋白Dna J-ΔA146Ply免疫小鼠后,能产生良好的保护作用。进一步的研究显示,免疫后的IL-4-/-小鼠相较WT小鼠,其生存率显著下降,菌载量升高,提示IL-4在Dna J-ΔA146Ply诱导的免疫效应中发挥了重要作用,但其机制尚不清楚。本研究将探索IL-4参
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目的:肺炎链球菌是呼吸道的正常定植菌,但可以通过侵入粘膜屏障引起多种疾病,疫苗是预防其感染的一种有效手段。本课题组前期的研究发现融合蛋白Dna J-ΔA146Ply免疫小鼠后,能产生良好的保护作用。进一步的研究显示,免疫后的IL-4-/-小鼠相较WT小鼠,其生存率显著下降,菌载量升高,提示IL-4在Dna J-ΔA146Ply诱导的免疫效应中发挥了重要作用,但其机制尚不清楚。本研究将探索IL-4参与Dna J-ΔA146Ply疫苗发挥保护作用中的具体机制。方法:通过皮下免疫Dna J-ΔA146Ply,比较WT和IL-4-/-小鼠抗体效价和Ig G亚型的差异。通过腹腔注射WT-Dna J-ΔA146Ply和IL-4-/--Dna J-ΔA146Ply抗血清对WT和IL-4-/-小鼠进行被动免疫,19F攻毒后,比较各组之间鼻咽部和肺部的菌载量差异。明确IL-4是否影响Dna J-ΔA146Ply诱导的抗体生成和功能。使用ELISA检测炎症因子表达以及观察肺组织的HE切片,比较WT和IL-4-/-小鼠的炎症情况。提取免疫后的WT和IL-4-/-小鼠的脾细胞,Dna J-ΔA146Ply蛋白刺激72h,采用ELISA检测比较各组细胞因子表达的差异,明确IL-4缺陷是否改变Dna J-ΔA146Ply诱导的细胞免疫效应。使用anti-IFN-γantibody中和Th1型细胞因子IFN-γ,观察免疫后的IL-4-/-小鼠的菌载量、炎症因子表达以及肺部病理损伤的差异。明确Th1/Th2失衡是否影响Dna J-ΔA146Ply发挥保护作用。提取WT和IL-4-/-小鼠的巨噬细胞和中性粒细胞,比较调理吞噬作用的差异。使用western blotting检测Syk和p-Syk的表达,探索IL-4激活的具体分子。使用Piceatannol抑制Syk的表达,通过抗体介导的调理吞噬实验、实时荧光定量PCR、western blotting比较WT和IL-4-/-小鼠抑制前后的差异。明确IL-4是否通过激活Syk参与Dna J-ΔA146Ply保护作用的发挥。结果:WT和IL-4-/-小鼠免疫Dna J-ΔA146Ply后,其抗体总效价没有显著差异（p>0.05）,但免疫后的IL-4-/-小鼠Ig G2b的效价有显著降低（p<0.05）。WT-Dna J-ΔA146Ply、IL-4-/--Dna J-ΔA146Ply抗血清分别被动免疫WT小鼠和IL-4-/-小鼠,19F攻毒后,IL-4-/-小鼠鼻咽部和肺部的菌载量相较于WT小鼠明显升高（p<0.05）;但两种血清免疫的WT小鼠的菌载量没有明显差异（p>0.05）。说明IL-4不影响Dna J-ΔA146Ply诱导的抗体生成和抗体的功能。被动免疫后的IL-4-/-小鼠,菌株攻毒后的炎症因子表达较免疫后的WT鼠显著升高（p<0.05）,肺部病理损伤也显著加重。免疫后的IL-4-/-小鼠的脾细胞上清中IFN-γ、IL-17A的表达较WT小鼠明显升高（p<0.05）。说明IL-4缺陷促进了Dna J-ΔA146Ply诱导的Th1型和Th17型细胞免疫效应,导致了Th1/Th2失衡。使用anti-IFN-γ抗体中和后,其菌载量、炎症因子的表达和肺部损伤情况均没有明显变化。说明IL-4缺陷后,细菌感染的炎症反应增强,但Th1/Th2失衡不是导致抗体在IL-4-/-小鼠中保护作用消失的关键因素。IL-4-/-小鼠巨噬细胞的调理吞噬功能较WT鼠增强（p<0.05）,中性粒细胞的调理吞噬功能较WT鼠减弱（p<0.05）。IL-4-/-小鼠调理后的中性粒细胞的Syk和p-Syk水平较WT鼠显著下调。Piceatannol抑制Syk表达后,WT鼠中性粒细胞的调理吞噬减弱（p<0.05）,Syk和p-Syk的水平均下调;IL-4-/-小鼠中性粒细胞的调理吞噬作用和p-Syk水平没有明显差异。以上结果表明IL-4可上调Syk和p-Syk的水平,增强中性粒细胞的调理吞噬功能。结论:IL-4缺陷不影响Dna J-ΔA146Ply诱导的抗体生成和抗体功能,但会引起其诱导的细胞免疫效应发生改变。同时,IL-4可通过激活Syk增强中性粒细胞的调理吞噬,参与Dna J-ΔA146Ply保护作用的发挥。本研究为IL-4在疫苗免疫中的机制提供了新的实验证据。
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