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研究背景流行病学资料提示,吸烟与动脉或静脉血栓形成关系密切。吸烟可以损伤血管内皮细胞,导致血管内皮细胞功能障碍,引发纤溶失衡,从而增加血栓形成的风险。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)为纤溶系统的主要成分,主要由血管内皮细胞合成和分泌,二者的动态平衡决定着纤溶系统的功能。有关吸烟对内皮细胞凝血-纤溶系统功能影响的研究多集中在凝血方面,吸烟对纤溶系统的影响研究较少,其作用机制尚不完全清楚。蛋白激酶C (PKC)为细胞内信号转导的重要通道,在血管内皮功能紊乱中发挥关键作用。尼古丁作为香烟烟雾中的主要有害物质之一,可损伤内皮细胞,导致纤溶系统功能下降,但这一作用是否通过PKC信号途径发挥作用未见报道。目的研究不同实验条件下尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs) t-PA及PAI-1表达的影响,选择尼古丁作用的最佳时间和浓度。进一步采用PKC抑制剂星型胞菌素Staurosporine(STS)作为干预药物,观察其对尼古丁诱导的内皮细胞t-PA、PAI-1蛋白和mRNA表达的影响。从体外实验探讨尼古丁对内皮细胞纤溶活性的影响,以及PKC途径在该变化中的作用。方法采用HUVECs细胞株进行以下实验。(1)尼古丁对血管内皮细胞纤溶活性影响的时间及浓度依赖性：HUVECs培养后接种于24孔培养板中,随机分为对照组及实验组,进行以下研究。①尼古丁作用的浓度依赖性：分别用0、0.1、1、10及100μmol/L的尼古丁孵育细胞,12h后收集各组上清液；②尼古丁作用的时间依赖性：用100μmol/L的尼古丁与细胞分别孵育0、4、6、8、12及24 h,收集各组上清液。采用酶联免疫吸附双抗体夹心分析法(ELISA)测定各组t-PA和PAI-1的抗原浓度。(2)PKC抑制剂(STS)干预实验：HUVECs培养后接种于25cm X 25cm的培养瓶中,随机分为对照组、尼古丁组、STS组及尼古丁+STS组。对照组培养液中不加任何干预；尼古丁组于培养液中加入终浓度为100μmol/L的尼古丁；STS组于培养液中加入终浓度为100nmol/L的STS；尼古丁+STS组于培养液中加入100nmol/L STS预处理细胞30min,再加入100μmol/L的尼古丁共同培养。同步培养12h后收集各组的细胞及上清液,采用酶联免疫吸附双抗体夹心分析法(ELISA)测定HUVECs培养液中t-PA和PAI-1的抗原浓度,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞t-PA和PAI-1 mRNA的表达水平。结果(1)尼古丁对HUVECs纤溶平衡的影响：HUVECs与不同浓度尼古丁孵育12h后,100μmol/L尼古丁组PAI-1蛋白表达较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；0.1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L尼古丁组PAI-1蛋白表达与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)；各浓度尼古丁组t-PA蛋白表达与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。HUVECs与100μmol/L的尼古丁分别孵育0、4、6、8、12及24 h后,各尼古丁组PAI-1蛋白表达均较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),且其升高呈时间依赖性；各尼古丁组t-PA蛋白表达与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。(2)STS在尼古丁介导HUVECs纤溶失衡中的作用：①尼古丁组PAI-1 mRNA及蛋白含量显著升高(1.321±0.198, (21.084±0.829) ng/ml),与对照组(0.729±0.100,(13.388±0.927) ng/ml)比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)；②尼古丁+STS组PAI-1 mRNA及蛋白含量(1.074±0.099, (16.190±2.149) ng/ml)较尼古丁组降低,但仍高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.01)；③尼古丁组t-PA mRNA的表达明显下降(0.193±0.073),与对照组(0.782±0.152)比较,差异有统计学意义(P<0.01)；t-PA蛋白((0.387±0.089)ng/ml)表达较对照组((0.461±0.090) ng/ml)有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05)；④尼古丁+STS组t-PA mRNA (0.394±0.076)的表达较尼古丁组升高,但仍低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.01)；t-PA蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论(1)尼古丁可上调HUVECs PAI-1 mRNA的表达,引起HUVECs PAI-1蛋白释放增高,对内皮细胞纤溶功能具有抑制作用。(2)尼古丁对HUVECs t-PA蛋白的影响不大,主要通过增加PAI-1含量,导致t-PA／PAI-1失衡而影响血管内皮细胞的纤溶活性。(3)PKC通道在尼古丁诱导的血管内皮细胞纤溶紊乱中发挥部分作用。