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本文利用绿色木霉T-YY液体发酵生产水溶性天然黄色素。初步发酵条件试验发现绿色木霉T-YY代谢产生黄色素与发酵培养基中碳源种类、马铃薯用量、通氧量及发酵时间有关。绿色木霉T-YY产黄色素的次生代谢以葡萄糖为适合碳源,当发酵培养基的碳源为蔗糖时,菌丝可以很好生长,但无黄色素产生。黄色素的产量(以发酵液吸光度值计)与发酵培养基中淀粉含量、通氧量及发酵时间成正比。实验所得黄色素粗品气味清香,色泽艳丽,发酵液的色价和黄色素粗产品产率分别为95.88 U/mL和6.7 mg/mL。
绿色木霉T-YY代谢产生的黄色素在紫外区及可见光区各有一个吸收峰,前者吸收强度大,峰型较锐,后者吸收强度中等,峰型较缓,最大吸收波长分别为286.5nm和380nm。
绿色木霉黄色素具有较好的热稳定性。80℃以下加热对色素几乎没有影响,色素水溶液100℃加热30min色素保留率仍高达90.2%,100℃加热120min,其色调仍保持亮黄色,无沉淀产生。
绿色木霉T-YY产生的黄色素在pH<5.0环境中稳定性较差,但在pH≥5.0环境中稳定性好。黄色素光稳定性较差,日光直射褪色较快,2d后色素保留率仅存48.24%,室内自然光照射色素水溶液7d后的色素保留率为95.49%,而在密封不与空气接触且避光条件下7d后色素保留率为99.01%。
绿色木霉产生的黄色素对还原剂敏感。实验中发现,在绿色木霉黄色素水溶液中添加 Na<,2>SO<,3>及Vc后,色素色调仍保持黄色,且无沉淀或浑浊出现,但溶液颜色随Na<,2>SO<,3>、Vc浓度增加而逐渐变浅,Abs值有较大幅度的降低,黄色素对氧化剂则较为稳定,在黄色素水溶液中加入H<,2>O<,2>或。HNO<,3>对色素溶液的Abs值和色素保留率的影响不大。
绿色木霉黄色素在含有具有氧化作用的Fe<3+>、Cu<2+>和具有还原作用的Mn<2+>的水溶液中易褪色,但在含Fe<2+>、Mg<2+>、Zn<2+>、Ca<2+>、K<+>、Na<+>的水溶液中色调稳定,且这些离子对绿色木霉黄色素均有不同程度的保护和增色作用,其中Fe<2+>、Mg<2+>对色素的增色作用尤其明显,静置24h后对应的色素保留率达99.3%、92.0%,高于对照的89.8%。
首次利用超高效液相及液-质联用技术对绿色木霉黄色素粗品进行分析。以添加1%甲酸的甲醇一水为流动相进行梯度洗脱可获得理想分离效果。结果显示,色素粗品中含有至少六种以上的黄色素,固相萃取条件表明该黄色素为带羧基的化合物,色素中主要成分的分子量为512Dal,在可见光区的最大吸收波长在372~396nm之间。
采用大孔吸附树脂AB-8纯化绿色木霉黄色素,其最优工艺条件是:黄色素粗品上样浓度为0.5mg/mL,吸附流速为1.5mL/min,洗脱剂为70%的乙醇,洗脱流速0.25mL/min。纯化后的绿色木霉黄色素在250nm~320nm的吸收峰峰高明显降低,在可见光区的最大吸收波长为379nm,与原液的可见光区最大吸收波长380nm趋于一致,可见大孔吸附树脂AB-8除去了色素粗品中不显色的杂质,很好地保留了目标物。
本实验验对绿色木霉黄色素抗氧化活性进行了评估,发现绿色木霉黄色素对羟基自由基、过氧化氢、超氧阴离子自由基具有不同程度的清除活性。绿色木霉黄色素对超氧阴离子的清除活性很高,并对Fe<2+>离子具有极佳的螯合能力,优于茶多酚、Vc、大豆异黄酮、葡萄籽提取物。
急性毒理实验显示,绿色木霉黄色素安全性高,其小鼠的LD<,50>远远大于5g/kg,根据GB 15193.3-2003 食品安全性毒理学评价程序和方法,属于实际无毒级别。