Fe3O4纳米颗粒对细胞低温保存过程传递现象的影响及其应用

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细胞、组织或者器官可以在低温下长期保存,但却极易在添加/去除低温保护剂、降温以及复温过程中遭受损伤而导致死亡。细胞在冷冻过程中遭受的低温损伤主要是渗透压超过细胞承受范围导致的溶液损伤和细胞内外溶液中冰晶的形成和生长、冰晶再结晶、玻璃化与反玻璃化等胞内冰损伤。纳米材料由于具有优良的导热性,抑制冰晶的形成和生长、增强降温速率、促进溶液玻璃化的转变等特性,可以应用于低温保存中降低低温损伤。我们研究了Fe304纳米颗粒对于低温保护剂添加/去除过程以及冷冻过程中传递现象的影响,并且利用Fe304纳米颗粒的电磁感应加热辅助玻璃化冻存的复温。本文首先设计并改进了微灌流腔系统,开发了一种更简便易用的微灌流显微镜装置用以测量细胞膜的渗透性参数。并且测定猪脂肪干细胞(pADSC)在不同温度下高渗磷酸盐缓冲盐水以及低温保护剂中细胞渗透响应过程,使用2-p模型拟合得到pADSCs的渗透系数。我们测定pADSCs的非渗透性体积(%),以及在不同温度下水的渗透系数(Lp),和CPA渗透率(Ps),然后定量分析温度对pADSC膜的传输性质的影响。根据得到的渗透参数进行优化CPA添加/去除过程,以降低低温保存过程中细胞的过度收缩造成的损伤。并且我们使用微灌流显微镜系统测定了Sf21细胞在25,15,5和-2℃下渗透响应过程,分别使用两者的K-K模型和2-p模型拟合体积变化过程,并比较了两种模型拟合的结果。本文以Sf21细胞为模型,发现Lp渗透系数在参考温度的数值(Lpg)与CPA的摩尔浓度线性,由此我们得到Sf21细胞膜的渗透系数对于温度和低温保护剂具有双重依赖的特定,并拓展了Arrhenius关系,最终结果验证了拓展后Arrhenius公式与实验数据非常符合。此后,我们测定了Fe3O4纳米颗粒对于细胞膜的渗透系数影响,使用微灌流腔系统测量了在25,15,5和-2℃下不同浓度氧化铁纳米颗粒对Sf21细胞渗透响应的影响,并且使用2-p模型拟合了相应的体积变化过程,得到细胞膜的渗透参数。通过测量不同浓度氧化铁纳米颗粒对Sf21细胞渗透参数的影响,发现氧化铁纳米颗粒明显改变细胞膜对于水的渗透参数。这些结果表明纳米颗粒加入后,Lp对于温度的敏感性显著降低,而纳米浓度的增加没有对Lp的温度敏感性产生很大的影响。同时,纳米颗粒的加入显著增加了Lpg,说明在0℃下Lp数值明显增加,而随着纳米颗粒浓度的增加,在0℃下Lp数值没有明显增加。为了研究Fe304纳米颗粒对低温冷冻中水输运和胞内冰形成的影响,通过低温显微镜我们测试了纳米颗粒对水输运和胞内冰形成的影响。定量分析了人脐带血内皮细胞(HUVECs)对Fe304纳米颗粒的摄入,并且使用透射电子显微镜(TEM)确定纳米颗粒进入HUVECs细胞内。利用低温显微镜测定了在不同的冷却速度下]HUVECs细胞的水输运和胞内冰现象,并通过水输运模型和胞内冰概率模型,拟合得到水渗透参数(Lpg,ELp)和胞内冰的形成概率参数(Ω,k)。定量分析了Fe304纳米颗粒在细胞外溶液中和在细胞内对水的渗透性和细胞内冰形成的影响。结果表明,Fe304纳米颗粒改善了冻结过程中水的运输,并且促进胞内冰的形成。这些重要的实验数据为HUVEC纳米冷冻保存提供了基础。为了解决复温过程中遇到的复温速率慢和温度不均匀等问题,我们探索了利用超顺磁性纳米颗粒的电磁感应加热作用辅助复温玻璃化冷冻的生物样品。我们使用共沉淀法合成了超顺磁性Fe304纳米颗粒并且对其进行表征,研究了Fe304纳米颗粒对于细胞玻璃化冻存的作用,并且使用电磁感应加热复温玻璃化冷冻的生物样品,优化了复温的条件并系统测定了复温后生物样品的存活率和生物功能等重要的指标。我们检测了超顺磁性Fe304纳米颗粒的细胞摄入以及对人脐带血干细胞(hUCM-MSC)增值的影响。结果表明,超顺磁性Fe304纳米颗粒可以进入到细胞内,并且少量的Fe3O4纳米颗粒对hUCM-MSC细胞增值没有影响。并且我们研究了超顺磁性Fe304纳米颗粒对低温冷冻保护液的玻璃化状态的影响,发现没有电磁加热的Fe304纳米颗粒对hUCM-MSC的玻璃化冷冻保存过程中没有显著影响,而复温过程中通过交变磁场加热Fe304纳米颗粒可以显著提高细胞的存活率。此外,利用MIH复温后,hUCM-MSCs细胞能够保持完整的干细胞性和分化功能。我们的研究结果表明,利用Fe304纳米颗粒在磁场下加热可以促进细胞玻璃化的复温过程,这种方法非常有潜力成为细胞低温保存的重要方法。
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