论文部分内容阅读
研究背景
阿尔茨海默症(Alzheimers Disease，AD)是一种对患者认知和记忆功能造成严重损害的中枢神经系统变性疾病。β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)诱导的神经毒性是阿尔茨海默氏病(AD)最重要的病理机制之一，但其作用机制不明。研究表明Aβ在线粒体内聚集，激活线粒体裂变并增加线粒体钙水平，损害线粒体功能，而线粒体功能障碍可以促进APP裂解产生Aβ，导致Aβ的异常积累，继而形成恶性循环，促进AD的发生和发展。因此从分子水平上研究线粒体功能障碍可能对了解Aβ诱导的神经细胞损伤和开发AD的有效治疗药物提供新的线索。
内质网与线粒体有物理上的接触的脂质筏状区域即被称为线粒体相关的内质网膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)。近来，MAM紊乱在AD的发病和病理过程中的潜在作用日益受到关注。MAM行为改变可能与AD表型中的各种功能障碍有关，如Aβ产生改变;线粒体损伤。IP3R-Grp75-VDAC1是MAM上的系链蛋白，将内质网与线粒体在结构上连接起来并介导内质网-线粒体间的钙转移，影响线粒体功能。肌醇需要酶1α(IRE1α)是一种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和内切核酸酶活性的跨膜蛋白。一旦激活，IRE1α从x-盒结合蛋白1(X-boxbindingproteinⅠ，XBP1)mRNA中去除26个碱基对的内含子，产生一个活性转录因子(XBP1s)。越来越多的证据表明，IRE1α-XBP1在AD中被激活并由Aβ肽触发，同时IRE1α的活化加剧AD的组织病理学进展。最近发现，IRE1α与IP3R相互作用，调节内质网到线粒体的钙转移。此外，IRE1α-XBP1抑制卵巢癌T细胞的线粒体呼吸。然而，在AD的发病过程中线粒体功能、IRE1α-XBP1和MAM三者之间的关系尚不明确。
研究目的
本研究从细胞方面进行研究，探讨IRE1α-XBP1对Aβ诱导的细胞毒性、线粒体功能的影响，阐明IRE1α-XBP1是否通过调控MAM影响Aβ处理的细胞线粒体功能，从而有利于寻找针对AD病因的防治手段。
研究方法
1.利用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞不同时间，通过RT-PCR、WesternBolt实验检测IRE1α、pIRE1α、XBP1s的表达。
2.将SH-SY5Y细胞分为对照组、4μ8c(IRE1α的小分子抑制剂)、Aβ组、Aβ+48c组。四组细胞通过MTT实验检测抑制IRE1α-XBP1对Aβ的细胞毒性的影响，通过钙离子成像技术检测抑制IRE1α-XBP1对Aβ处理的细胞功能状态的影响。
3.通过荧光法检测ATP产生量、TMRM染色检测线粒体膜电位、MitoSOXRed染色检测线粒体活性氧
4.通过透射电镜观察各组细胞MAM的数量、长度
5.通过钙成像技术检测细胞质和内质网中的钙离子水平，以及免疫荧光技术进一步检测细胞质、线粒体和内质网的钙离子水平
6.通过WesternBlot检测MAM系链蛋白IP3R-Grp75-VDAC1的表达，以及CO-IP检测IP3R-Grp75-VDAC1的相互作用。
研究结果
1.Aβ激活IRE1α-XBP1通路。
2.抑制IRE1α-XBP1减轻Aβ的细胞毒性。
3.抑制IRE1α-XBP1增强ATP含量、恢复线粒体膜电位、降低线粒体活性氧水平从而减轻Aβ诱导的细胞线粒体功能障碍。
4.抑制IRE1α-XBP1减少Aβ引起的MAM数量和长度的增加。
5.抑制IRE1α-XBP1减少Aβ引起的内质网-线粒体间的钙转移。
6.抑制IRE1α-XBP1降低Aβ诱导的IP3R-Grp75-VDAC1的表达和相互作用。
结论
Aβ激活IRE1α-XBP1通路，抑制IRE1α-XBP1通路可以缓解Aβ诱导的细胞线粒体功能障碍，这可能是通过减少MAM系链蛋白IP3R-Grp75-VDAC1的表达及相互作用进而减少MAMs形成，降低内质网到线粒体的钙转移实现的。
阿尔茨海默症(Alzheimers Disease，AD)是一种对患者认知和记忆功能造成严重损害的中枢神经系统变性疾病。β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)诱导的神经毒性是阿尔茨海默氏病(AD)最重要的病理机制之一，但其作用机制不明。研究表明Aβ在线粒体内聚集，激活线粒体裂变并增加线粒体钙水平，损害线粒体功能，而线粒体功能障碍可以促进APP裂解产生Aβ，导致Aβ的异常积累，继而形成恶性循环，促进AD的发生和发展。因此从分子水平上研究线粒体功能障碍可能对了解Aβ诱导的神经细胞损伤和开发AD的有效治疗药物提供新的线索。
内质网与线粒体有物理上的接触的脂质筏状区域即被称为线粒体相关的内质网膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)。近来，MAM紊乱在AD的发病和病理过程中的潜在作用日益受到关注。MAM行为改变可能与AD表型中的各种功能障碍有关，如Aβ产生改变;线粒体损伤。IP3R-Grp75-VDAC1是MAM上的系链蛋白，将内质网与线粒体在结构上连接起来并介导内质网-线粒体间的钙转移，影响线粒体功能。肌醇需要酶1α(IRE1α)是一种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和内切核酸酶活性的跨膜蛋白。一旦激活，IRE1α从x-盒结合蛋白1(X-boxbindingproteinⅠ，XBP1)mRNA中去除26个碱基对的内含子，产生一个活性转录因子(XBP1s)。越来越多的证据表明，IRE1α-XBP1在AD中被激活并由Aβ肽触发，同时IRE1α的活化加剧AD的组织病理学进展。最近发现，IRE1α与IP3R相互作用，调节内质网到线粒体的钙转移。此外，IRE1α-XBP1抑制卵巢癌T细胞的线粒体呼吸。然而，在AD的发病过程中线粒体功能、IRE1α-XBP1和MAM三者之间的关系尚不明确。
研究目的
本研究从细胞方面进行研究，探讨IRE1α-XBP1对Aβ诱导的细胞毒性、线粒体功能的影响，阐明IRE1α-XBP1是否通过调控MAM影响Aβ处理的细胞线粒体功能，从而有利于寻找针对AD病因的防治手段。
研究方法
1.利用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞不同时间，通过RT-PCR、WesternBolt实验检测IRE1α、pIRE1α、XBP1s的表达。
2.将SH-SY5Y细胞分为对照组、4μ8c(IRE1α的小分子抑制剂)、Aβ组、Aβ+48c组。四组细胞通过MTT实验检测抑制IRE1α-XBP1对Aβ的细胞毒性的影响，通过钙离子成像技术检测抑制IRE1α-XBP1对Aβ处理的细胞功能状态的影响。
3.通过荧光法检测ATP产生量、TMRM染色检测线粒体膜电位、MitoSOXRed染色检测线粒体活性氧
4.通过透射电镜观察各组细胞MAM的数量、长度
5.通过钙成像技术检测细胞质和内质网中的钙离子水平，以及免疫荧光技术进一步检测细胞质、线粒体和内质网的钙离子水平
6.通过WesternBlot检测MAM系链蛋白IP3R-Grp75-VDAC1的表达，以及CO-IP检测IP3R-Grp75-VDAC1的相互作用。
研究结果
1.Aβ激活IRE1α-XBP1通路。
2.抑制IRE1α-XBP1减轻Aβ的细胞毒性。
3.抑制IRE1α-XBP1增强ATP含量、恢复线粒体膜电位、降低线粒体活性氧水平从而减轻Aβ诱导的细胞线粒体功能障碍。
4.抑制IRE1α-XBP1减少Aβ引起的MAM数量和长度的增加。
5.抑制IRE1α-XBP1减少Aβ引起的内质网-线粒体间的钙转移。
6.抑制IRE1α-XBP1降低Aβ诱导的IP3R-Grp75-VDAC1的表达和相互作用。
结论
Aβ激活IRE1α-XBP1通路，抑制IRE1α-XBP1通路可以缓解Aβ诱导的细胞线粒体功能障碍，这可能是通过减少MAM系链蛋白IP3R-Grp75-VDAC1的表达及相互作用进而减少MAMs形成，降低内质网到线粒体的钙转移实现的。