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近年随着研究的深入，许多抗感染、肿瘤的天然免疫分子不断出现。人甘露糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶-2(Mannan-binding lectinassociated serine protease 2，MASP-2)是天然免疫系统中的一种重要分子，属于丝氨酸蛋白酶家族，在补体激活的凝集素途径中发挥至关重要的作用。MASP-2在血浆中以酶原形式存在，MBL或Ficolin通过CRD识别并结合病原微生物表面的甘露糖、岩藻糖及N-乙酰葡萄糖等结构，激活与之相连的MASP-2，活化的MASP-2能以类似Cls的方式依次裂解C4和C2，形成C3转化酶(C4b2a)进而激活后续的补体成分。已有研究表明，MASP-2血清含量的变化与肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病密切相关。因此，急需建立有效的检测MASP-2血清含量的方法，应用于临床相关疾病的诊断。
我们已经得知，MASP-2蛋白的分子结构由6个结构域构成，N端的CUB1区(Clr/Cls,Uegf,BMP1)、EGF区(epidermal growth factor-likedomain)、CUB2区、2个CCP区(complement control protein domain)和C端的SP区(serine protease domain)。N端结构域是和MBL复合物的结合区域，C端的SP区发挥真正的催化功能，两个功能域相对独立。因此，我们可以利用MASP-2蛋白，以及MASP-2蛋白的N端多肽和C端多肽片段作为抗原，免疫动物制备单克隆抗体，用于血清MASP-2含量的检测。
目的：分析克隆MASP-2蛋白的cDNA，并构建原核表达载体，在大肠杆菌中表达MASP-2蛋白，以及MASP-2蛋白的N端多肽和C端多肽片段，为进一步建立检测MASP-2含量的ELISA方法，以及肿瘤等疾病的临床辅助诊断和治疗奠定基础。
方法：①以人胎肝组织作为实验材料，应用Triol试剂提取总RNA作为模板，采用两步法RT-PCR，合成cDNA。②查阅文献，检索MASP-2信息，根据MASP-2序列设计MASP-2、MASP-2N端和MASP-2C端的引物，PCR扩增得到目的基因。③采用常规酚-氯仿法提纯扩增的目的基因与pGEX-6p-2载体，用BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切处理。④纯化消化产物，用T4连接酶连接成为重组体。⑤将重组体转化感受态细胞XL1-blue，接种在含有100mg/LAmp的选择性培养基LB平板上，37℃过夜培养。⑥使用针对pGEX-6p-2载体引物的PCR初步筛选阳性生长菌落；对PCR扩增阳性的克隆提取质粒，进一步采用交叉-PCR和重组质粒酶切进行鉴定。⑦对交叉PCR扩增阳性的质粒进行测序并进行序列分析。⑧用IPTG诱导表达GST重组蛋白，用Glutathione SepharoseTM4B纯化重组蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。
结果：
①获得了载体重组质粒pGEX-6p-2/MASP-2、pGEX-6p-2/MASP-2N和pGEX-6p-2/MASP-2C。经过用针对pGEX-6p-2载体的引物初步筛选后进一步提取重组质粒，经过pGEX-6p-2的引物和特异性引物进行交叉PCR扩增，获得的扩增产物与预期结果一致。重组质粒pGEX-6p-2/MASP-2中克隆了长度为2061bp的MASP-2蛋白的cDNA，重组质粒pGEX-6p-2/MASP-2N中克隆了长度为1332bp的MASP-2N端多肽片段的cDNA，重组质粒pGEX-6p-2/MASP-2C中克隆了长度为729bp的MASP-2C端多肽片段的cDNA。直接以重组质粒pGEX-6p-2/MASP-2、pGEX-6p-2/MASP-2N和pGEX-6p-2/MASP-2C为模板进行测序，得到克隆片段的DNA序列，与基因库中的序列比对一致。
②选取阳性克隆诱导表达重组蛋白，经过纯化后进行SDS-PAGE电泳，显示条带与预期结果一致。MASP-2蛋白由686个氨基酸残基组成（包含1个15个氨基酸残基组成的信号肽），分子量为74kDa，MASP-2N端多肽片段由444个氨基酸残基组成，MASP-2C端多肽片段由242个氨基酸残基组成。
结论：
①从人胎肝组织中成功获得了MASP-2蛋白的cDNA，MASP-2N片段的cDNA和MASP-2C片段的cDNA。
②成功构建了pGEX-6p-2/MASP-2、pGEX-6p-2/MASP-2N和pGEX-6p-2/MASP-2C重组表达载体。
③成功地在大肠杆菌表达出GST-MASP-2、GST-MASP-2N和GST-MASP-2C3个GST融合蛋白。