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第一部分 聚乙烯亚胺-葡聚糖四氧化三铁磁性纳米粒子合成与表征目的:合成带正电荷的聚乙烯亚胺-葡聚糖四氧化三铁磁性纳米粒子（polyethyleneimine-dextran coated iron oxide nanoparticle,PDI）,通过表征验证该材料的性能。方法:利用化学共沉淀法合成超顺磁性葡聚糖四氧化三铁纳米粒子（dextran coated iron oxide nanoparticle,DI）,经高碘酸钠催化合成醛基化的磁性纳米粒（ADI）,通过形成席夫碱完成聚乙烯亚胺（polyethyleneimine,PEI）与ADI的嫁接,并通过静电吸附作用复合了PDI与miR-302b过表达质粒。以傅里叶红外光谱仪检测醛基等功能基团,透射电镜检测形态、大小,激光粒度仪检测水流动力学直径、zeta电位,热重分析仪检测材料的热失重,振动样品磁强计检测磁性能,紫外分光光度计检测质粒DNA浓度并估算包封率,琼脂糖凝胶检测PDI与质粒结合是否稳定。结果:我们合成了超顺磁性葡聚糖四氧化三铁纳米粒子、聚乙烯亚胺-葡聚糖四氧化三铁纳米粒子,DI电镜下粒径约5.11±1.17 nm,形态呈圆球形,有一定的团聚现象。红外光谱仪结果显示,ADI在1737.6 cm-1有吸收峰,证实了葡聚糖外壳中羟基（-OH）氧化为了醛基（-CHO）。激光粒度仪数据显示Fe3O4、DI水流动力学直径依次为83.55±2.09 nm、105.33±1.17 nm,zeta电位依次是-5.23±1.01 m V、-1.76±0.13 m V,而PEI/ADI最优质量比为30,此时PDI水流动力学直径为148.67±1.52 nm,zeta电位是32.50±0.62 m V。热重分析仪结果显示DI、ADI、PDI失重率依次为71.80%、61.66%、59.16%,证实了聚乙烯亚胺的成功嫁接。磁滞回线结果显示DI、PDI的饱和磁化强度依次是6.63 emu/g、5.31emu/g,剩余磁化强度、矫顽力均为0,表现为超顺磁性,表明聚乙烯亚胺的嫁接对磁性纳米粒的磁性能无明显影响。琼脂糖凝胶电泳显示了PDI对质粒DNA具备强大的结合能力,结合稳定性强,紫外分光光度计技术包封率为99.8±0.2%。MTT结果显示,PDI在10μg/m L时,293T、143B、MG63细胞的相对活力依次为86.0±2.6%,91.3±5.0%和88.3±6.7%,而PDI在最高浓度300μg/m L时,293T、143B、MG63细胞的相对活力依次为75.33±7.37%、69.33±3.22%、47.0±4.58%,证实了PDI在极高浓度对细胞有一定毒性,而在10μg/m L时细胞毒性低,因此选用该浓度进行后续实验。结论:本研究成功合成了阳离子化的聚乙烯亚胺-葡聚糖四氧化三铁磁性纳米粒子,粒径小,具备超顺磁性,与质粒DNA能形成稳定的复合物,包封率高,对细胞毒性低,可能用于miRNA等基因治疗的应用。第二部分 负载miR-302b的磁性纳米粒子体外抗骨肉瘤作用研究目的:细胞水平研究负载miR-302b的磁性纳米粒子（PDI/miR-302b）对骨肉瘤细胞增殖、迁移和凋亡的调控作用及分子机制的探讨。方法:PDI/miR-302b与骨肉瘤细胞培养后,24h后采用MTT法检测骨肉瘤细胞增殖能力改变,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,划痕试验检测细胞迁移能力,外加磁场检测PDI/miR-302b的磁靶向能力,荧光显微镜、RT-PCR检测PDI/miR-302b的转染效率,普鲁士蓝染色法、透射电镜检测骨肉瘤细胞对PDI/miR-302b的内化情况。为研究miR-302b抗骨肉瘤机制,本研究通过生物信息学软件、网站预测miR-302b潜在靶基因YOD1,双荧光素酶报告系统验证miR-302b与靶基因能否互补结合。探讨miR-302b对骨肉瘤143B细胞YOD1、Hippo通路的调控作用,RT-PCR检测PDI/miR-302b处理后143B细胞的YOD1、Hippo通路相关基因的相对表达量。设计Rescue实验,实验分组为:miR-302b上调组（mimic+YOD1-ctrl）,miR-302b上调+YOD1上调组（mimic+YOD1）,YOD1上调组（mimic-NC+YOD1）,对照组（mimic-NC+YOD1-ctrl）,采用MTT法检测细胞增殖能力,细胞划痕试验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:PDI/miR-302b与143B培养后,在荧光显微镜下,3h即有绿色荧光并逐渐增强,48h达到最强,磁场处理能增强荧光蛋白的表达。PDI/miR-302b与143B培养48h后,RT-PCR结果显示,143B、MG63、U2OS细胞中miR-302b相对表达量分别为1.81±1.44、1.29±1.05、1.28±0.23,磁场处理组则为10.90±3.50、13.71±2.65、10.11±0.99,差异有统计学意义（P<0.05）,磁场明显增加了PDI的转染效率。MTT数据显示无磁场处理组的细胞活力明显高于磁场处理组,差异有统计学意义（P<0.05）,磁场处理组诱导143B细胞凋亡的能力明显强于无磁场处理组,差异有统计学意义（P<0.05）,细胞划痕试验显示磁场处理组的细胞划痕愈合明显减慢。在143B、MG63、U2OS细胞系中的YOD1基因表达明显高于人成骨细胞系h FOB1.19。磁场处理组的YOD1、ITCH、YAP基因表达下降且明显低于无磁场处理组,LATS1基因表达增高且高于无磁场处理组,差异均有统计学意义（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-302b转染后明显抑制了pmir GLO-YOD1-3’-UTR-wt的荧光素酶活性,而对突变型pmir GLO-YOD1-3’-UTR-MUT的荧光素酶活性未见显著影响。相对于miR-302b mimic+YOD1-ctrl组,mimic+YOD1组下调了LATS1的表达水平,上调了YOD1、ITCH、YAP基因的m RNA表达水平,并且mimic+YOD1组的细胞划痕愈合速度加快、抗凋亡作用增强,证实YOD1的过表达能抑制miR-302b对骨肉瘤细胞的作用。结论:PDI能负载miR-302b运输到细胞中并发挥抗骨肉瘤作用,这种作用可被磁场增强。miR-302b可能通过靶向YOD1使Hippo通路失活而调控骨肉瘤的增殖、迁移和凋亡。第三部分 动物水平研究PDI/miR-302b磁性纳米粒子抗骨肉瘤的作用目的:通过荷骨肉瘤裸鼠探讨PDI/miR-302b在体内水平抗骨肉瘤生长的作用及其磁响应性。方法:构建皮下骨肉瘤裸鼠模型后,裸鼠随机分为五组给药,每组5只:对照（control）组,PDI组,pmiR-302b组,PDI/miR-302b组,PDI/miR-302b+磁场组。每天测量瘤体大小,三天给药1次,给药达三周后,处死裸鼠,解剖分离瘤体、内脏等组织,进行HE染色观察病灶坏死情况,普鲁士蓝染色观察瘤体内葡聚糖四氧化三铁成分,ICP-OES检测脏器中铁元素含量。结果:各组的瘤体体积给药后7天、14天、21天从大到小依次是对照组、PDI组、pmiR-302b组、PDI/miR-302b组、PDI/miR-302b加磁场组,差异有统计学意义。瘤体组织HE染色结果显示肿瘤坏死区域从大到小依次是PDI/miR-302b加磁场组、PDI/miR-302b组、pmiR-302b组、PDI组、对照组。普鲁士蓝染色表明PDI/miR-302b加磁场后,细胞内的铁成分多于PDI/miR-302b组,而ICP-OES数据显示加磁场后肝脏、脾脏中的铁元素明显降低,证实了磁铁对PDI/miR-302b的靶向性。结论:PDI/miR-302b可抑制荷骨肉瘤裸鼠的瘤体生长,磁场可加强其靶向性和抗肿瘤作用。