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Trk (tropomyosin-related kinase,原肌球蛋白相关激酶)是细胞膜表面的一类重要酪氨酸激酶,其在神经细胞的存活、增殖、分化、迁移、凋亡以及学习和记忆等高级功能中都扮演着关键角色。Trk受体属于受体酪氨酸激酶超家族,一共有三个家族成员：TrkA、TrkB和TrkC.他们的高亲和力配体是神经营养因子(neurotrophins)家族,该家族成员包括NGF、BDNF、NT-3、NT-4等等。通过与神经营养因子相结合,Trk受体迅速二聚化并激活其自身酪氨酸激酶活性,进而可以募集多种胞浆信号蛋白并将其磷酸化,从而将胞外信号传递至胞内。Dok(downstream of tyrosine kinase/Docking protein)是一类重要的胞浆接头蛋白,参与了多个信号通路的转导。该家族由七个成员组成：Dokl至Dok7。Dok家族蛋白符合胞浆信号蛋白的典型结构特征：N端PH结构域、中央PTB结构域以及C末端区域,因此可以作为多种非受体酪氨酸激酶(如Src家族激酶)及受体酪氨酸激酶(如胰岛素受体、c-Ret受体、Trk受体等)的底物被募集及磷酸化,从而调节下游信号。本室前期工作表明Dok5可以与TrkB和TrkC受体相互作用并作为二者的底物激活MAPK信号通路。由于Dok5与Dok6均在神经系统特异性高表达,并且同源性分析结果显示二者在同家族的七个成员中同源性最高,因此我们预测Dok6可能也参与神经系统中Trk受体家族的信号转导过程。接下来,首先利用酵母双杂交系统进行了验证。结果证明在酵母双杂交系统中,Dok6与TrkC受体的胞内区有明显相互作用,而与TrkA和TrkB的相互作用很弱。通过结构域分段克隆,进一步证明了Dok6是通过其PTB结构域与TrkC受体发生相互作用的。以上试验结果在GST-pulldown和CoIP实验中得到了进一步的证实。随后利用氨基酸突变分析的方法明确了Dok6通过其PTB结构域结合于TrkC受体胞内区的NPQY模体,并且这种相互作用依赖于受体的激酶活性。为了在神经系统内验证上述相互作用,我们利用原位杂交及免疫荧光实验证实TrkC受体与Dok6在来源于小鼠大脑皮层的原代培养的神经元中共定位,并且免疫沉淀实验进一步在体内证实了二者的相互作用,提示Dok6在神经系统中作为TrkC受体的底物行使重要功能。通过RNA干扰技术,在原代培养的小鼠大脑皮层神经元中敲低Dok6的表达并证明其在神经突起的生长过程中发挥重要作用,随后通过外源性NT-3的刺激证实Dok6作为TrkC受体的底物通过NT-3/TrkC通路在原代培养的小鼠大脑皮层神经元的神经突起生长过程中发挥作用。最后,利用免疫沉淀及质谱鉴定的方法鉴定出可能与Dok6发生相互作用的26个蛋白,通过对其进行生物信息学分析最终锁定9个参与了神经系统发育及细胞内信号转导的靶蛋白。综上所述,我们证实了Dok6依赖其PTB结构域结合于活化的TrkC受体的NPQY模体,并且作为TrkC受体的底物通过NT-3/TrkC通路在原代培养的小鼠大脑皮层神经元的神经突起生长过程中发挥重要作用。这不但为进一步揭示Dok6的生理功能奠定了基础,并为治疗一些神经系统疾病提供了重要线索。