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猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以脱水、腹泻、肠绒毛严重萎缩为主要病变的传染病。2010年以来,PEDV变异株在世界多国猪场相继暴发流行,其对哺乳仔猪致病性强、死亡率高,一周龄以下的仔猪感染后其致死率可高达100%。该PEDV变异株的出现在我国及全球造成重大经济损失,严重威胁着养猪业的健康发展,开发用于检测PEDV感染的制剂和相应方法显得尤为重要且紧迫。核衣壳蛋白(N)在不同的PEDV毒株间高度保守、且在宿主感染早期合成,因此,PEDV N蛋白是作为感染早期检测的理想靶标。为有助于开发一系列检测PEDV感染的方法,本研究制备了抗PEDV N蛋白的单克隆抗体,并测试了其在不同检测方法中的应用前景。首先,本研究从PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法扩增获得了N基因,随后将其因克隆至pET-30a(+)原核表达载体,获得了表达PEDV N蛋白的重组表达质粒,并将其命名为pET-N。将pET-N转化至BL-21(DE3)感受态细胞中表达N蛋白,结果表明,该目标蛋白以分泌型及包涵体形式同时表达。经优化表达条件,最终获得大量分泌型表达的N蛋白。采用镍柱亲和层析技术对所获得的重组N蛋白进行纯化,结果显示,本研究获得高纯度的PEDV N蛋白。将200μg纯化后的PEDV N蛋白与ISA15佐剂混合后于背部皮下多点免疫BALB/c小鼠,每两周以相同剂量及方式进行加强免疫。第三次免疫一周后,采用等量N蛋白于腹腔注射进行加强免疫,3 d后处死小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过三轮亚克隆筛选后,共获得6株稳定分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经单克隆抗体分型试剂盒鉴定,该6株单克隆抗体(mAbs)的重链均为IgG1亚类,轻链为?链。制备6株mAbs的腹水,其抗体滴度均在稀释度128000倍以上。除采用ELISA检测纯化后的PEDV N蛋白与mAbs的反应性外,我们还采用IFA和流式细胞术检测PEDV LJX/2014毒株接种的Vero-E6细胞与6株mAbs的反应性,同时用Western blotting检测其细胞裂解物与mAbs的反应性,上述结果均显示,本课题制备的mAbs均能用于间接免疫荧光(IFA)、Western blotting以及流式细胞术的检测分析。采用截短表达的策略,对mAb进行表位鉴定,采用间接ELISA方法分析这6株mAbs的表位所在区段。结果表明,3F12单抗株识别线性表位VAAKDALKSLGI,推测其余单抗株分别识别N181-379区段内的不同构象表位。综上所述,本研究成功制备了6株针对PEDV N蛋白的mAbs;测定了6株mAbs的亚型及其亲和性;分析了它们在ELISA、IFA、Western blotting和流式细胞术等方法中的应用;制备了6株mAbs的腹水,鉴定了mAbs的抗原表位。