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第一部分 DNA胞嘧啶修饰碱基含量变化与小肝癌临床预后关系研究目的:探索新型肝癌分子诊断标志物,对及早发现和规范治疗及改善肝癌预后具有重要意义。本研究目标为阐明小肝癌DNA胞嘧啶修饰碱基含量变化与小肝癌复发、转移及预后的关系,为小肝癌治疗及生存预后提供评价依据。方法:本研究所有病例均符合入组标准,应用质谱检测63例小肝癌基因组DNA胞嘧啶修饰碱基5m C、5hm C、5f C含量;应用免疫组化检测66例小肝癌5hm C含量及CD133、CD44、CK19、OV6、Ep CAM等肝癌干细胞标志物的表达,比较分析与临床病理因素、生存预后的关系。结果:1、质谱分析检测发现癌组织基因组DNA中5m C、5hm C、5f C含量较癌旁组织明显下降(P<0.05),相关性分析显示癌5m C含量与癌5hm C含量、癌5hm C含量与癌5f C含量呈正相关性(P<0.05)。病理因素关联性分析发现癌5m C含量与血HBV-DNA含量,癌旁5m C含量与AFP、微血管癌栓、肿瘤转移有关(P<0.05);癌5hm C含量与生存时间、血HBV-DNA含量,癌旁5hm C含量与肿瘤转移、AFP、生存时间,癌组织5hm C/癌旁5hm C与T分期、微血管癌栓、血HBV-DNA含量有关(P<0.05);癌组织5f C含量与肿瘤大小、AFP、生存时间,癌旁5f C含量与肝硬化,癌组织5f C/癌旁组织5f C与微血管癌栓、T分期有关(P<0.05);癌组织HBV-DNA含量与肝硬化有关(P<0.05),与其他病理因素无关。预后生存单因素分析显示癌5hm C含量、癌5hm C含量/癌旁5hm C、癌5f C含量、术后复发、肿瘤包膜、微血管癌栓、Child-Pugh分级、T分期与小肝癌患者无病生存期、总生存期有关,另外血HBV-DNA也与无病生存期有关(P<0.05);COX多因素分析表明癌5hm C含量、术后复发、肿瘤转移是小肝癌患者无病生存期、总生存期的独立预后因素,微血管癌栓也是总体生存期独立预后因素之一(P<0.05)。肝癌细胞系DNA碱基修饰含量具有差异性,乙肝阳性的肝癌细胞5m C、5hm C、5f C含量低于乙肝阴性细胞。2.免疫组化检测发现癌旁5hm C含量、CK19表达明显高于癌组织(P<0.05);CD133、CD44、OV6、Ep CAM肝癌干细胞标志物在癌及癌旁组织中整体表达水平低,无统计学差异(P>0.05)。在小样本分析中,近癌旁组织中CK19的表达阳性细胞中5hm C染色阳性的细胞数量越多,发生转移可能性越高、死亡率也越高(P<0.05)且无病生存时间、总体生存时间也越短(P<0.01),预后越差。但扩大样本后与无病生存时间、总体生存时间无关。结论:小肝癌5hm C、5f C含量与复发、转移及生存预后密切相关,癌中DNA胞嘧啶修饰碱基含量可能作为小肝癌复发、预后的潜在生物学标志物,具有重要的潜在临床应用价值,值得进一步深入研究。第二部分IRAK1在肝癌细胞增殖、迁移及细胞周期中的作用研究目的:基于前期研究发现IRAK1在肝癌及肝癌细胞系中明显升高及在不同位点磷酸化状态及水平的差异,预示IRAK1在肝癌发生发展中发挥了重要作用。本研究通过运用IRAK1的磷酸化抑制剂,研究了抑制IRAK1活性对肝癌细胞迁移、增殖、凋亡、细胞周期以及裸鼠皮下瘤体生长等生物学功能中的作用及机制,揭示靶向IRAK1在肝癌治疗中的重要作用。方法:1.分别采用免疫组化法、Western Blot技术检测人肝癌组织、癌旁组织及肝癌细胞系中p-IRAK1表达水平。2.应用Western Blot技术检测IRAK1/4小分子抑制剂对肝癌细胞系中IRAK1、p-IRAK1表达水平的影响;探索不同剂量IRAK1/4小分子抑制剂对肝癌细胞系IRAK1、p-IRAK1(T209)的作用效果。3.采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)增殖实验、细胞克隆实验研究IRAK1/4小分子抑制剂抑制p-IRAK1的磷酸化水平后对肝癌细胞增殖能力的影响。4.运用Transwell迁移实验、划痕实验研究抑制p-IRAK1水平后对肝癌细胞的粘附、迁移能力的影响。5.运用AnnexinV和PI染色联合流式细胞术,观察IRAK1/4小分子抑制剂下调p-IRAK1(T209)的磷酸化水平时肝癌细胞凋亡和细胞周期的变化情况。6.动物实验研究IRAK1/4小分子抑制剂对小鼠皮下肝癌荷瘤的生长情况的影响作用,运用免疫组化法检测肝癌皮下肝癌荷瘤增殖因子变化情况。结果:1.通过免疫组化检测p-IRAK1(T209)在肝癌组织中的表达水平明显高于相应的癌旁组织;Western Blot检测结果显示各种肝癌细胞系的p-IRAK1(T209)表达水平也比肝正常细胞系高。2.Western Blot检测结果显示,IRAK1/4抑制剂能明显下调多种肝癌细胞系中p-IRAK1(T209)水平,并且其下调水平与抑制剂浓度呈正相关,20um IRAK1/4抑制剂是较理想抑制剂量,而p-IRAK1(S376)、IRAK1总体水平变化不明显。3.IRAK1/4抑制剂可通过下调p-IRAK1(T209),有效抑制肝癌细胞增殖、迁移能力,降低肝癌细胞的克隆水平。4.IRAK1/4抑制剂下调肝癌细胞p-IRAK1(T209)水平后,可诱导肝癌细胞凋亡,引起肝癌细胞周期阻滞。5.IRAK1/4抑制剂能明显抑制肝癌皮下荷瘤的生长,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。结论:验证了肝癌细胞靶向IRAK1通过p-IRAK1(T209)的水平及状态改变来调控肝癌细胞迁移、增殖、凋亡、细胞周期等生物学功能;进一步证实了IRAK1/4小分子抑制剂可通过抑制p-IRAK1(T209)水平进而抑制肝癌细胞增殖及肿瘤生长的重要作用;初步表明IRAK1在肝癌发生发展过程中的作用可能与IRAK1磷酸化水平密切相关,为IRAK1肝癌靶向治疗提供了新的治疗理论基础和实践证明。