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第一部分:大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的建立目的:建立一种简便可靠,创伤较小的Wistar大鼠局灶性脑缺血模型。方法:参照Zealonga及Koizum的线栓法,加以改进,制作wistar大鼠局灶性脑缺血模型,随后行神经行为学检查判断梗死结果,以观察模型的可靠性.结果:模型大鼠出现神经功能障碍,脑组织缺血梗死。结论:该改良法制备的模型简便易行,结果可靠,创伤小,稳定性好,是用于研究局灶性脑缺血较为理想的实验动物模型。第二部分:脑缺血再灌注损伤后NGB、p-ERK1/2的表达与变化研究目的研究大鼠脑缺血再灌注损伤后额叶皮质、海马CA1区脑红蛋白(neuroglobin,NGB)与细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)表达的动态变化以及脑红蛋白在血清中的表达变化与再灌注时间的关系,通过细胞外调节蛋白激酶特异性拮抗剂PD98095干预,初步探讨NGB与ERK1/2的相互关系以及可能的上游调控机制。方法选取健康清洁级Wistar大鼠65只,随机分为13组,每组5只。A组(假手术组Sham组)仅分离椎动脉和颈总动脉,并不进行插线;B组为缺血/再灌注组,依据再灌注4h、8h、16h、32h、64h、128h不同时间点分为六个亚组;C组PD98095干预组,依据再灌注4h、8h、16h、32h、64h、128h不同时间点分为六个亚组,缺血前30min腹腔注射PD98095 65mg/kg。建立大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型,通过免疫组化法测定损伤后不同时间点大鼠大脑额叶皮质、海马CA1区NGB与p-ERK1/2阳性细胞数。同样选取健康清洁级Wistar大鼠24只,随机分为2组:假手术对照组(3只),缺血再灌注lh、4h、8h、16h、32h、64h、128h组(每组3只)。缺血再灌注组制备MCAO模型,假手术组手术过程同缺血再灌注组,仅暴露颈总动脉,不插线。通过双抗夹心ELISA法测大鼠血清NGB浓度。应用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析,先用Bartlett法行方差齐性检验,方差齐的指标行单因素方差分析(ANOVA),在方差分析有显著性的基础上,各组之间的两两比较采用q检验。相关分析采用直线相关法。P < 0.05有统计学意义结果:1.额叶皮质与海马CA1区NGB的表达假手术组的表达程度最低,再灌注4-128h后,缺血再灌注组缺血侧额叶皮质NGB阳性表达的神经元呈现出先增加后减少的趋势,再灌注损伤后4h,缺血侧额叶皮层NGB阳性神经元数量开始有所增加(p≦0.05),损伤后8-16h,NGB阳性神经元数量显著增加(p﹤0.01),并在损伤后32h阳性细胞数量增加达到高峰。损伤64h后,NGB阳性神经元数量明显减少,到128h后与假手术对照组额叶皮层NGB阳性神经元数量基本相当。海马CA1区NGB阳性神经元也呈现出先上升后下降的趋势,各时间点升降变化与额叶皮质区相似,但各时间点阳性细胞数均较额叶皮质区为少(p﹤0.01).PD98059干预组在额叶皮质和海马CA1区NGB阳性神经元变化趋势与再灌注组一致,但升幅非常显著低于再灌注组(P<001)。在不同区域各时间点再灌注组与干预组之间有明显差异(P﹤0.01),而在再灌注组128h与干预组128h之间无明显差异(P>0.05)。根据各组均值,可认为在同一处理组内,随着再灌注时间的延长,NGB值增大.而在同一时间点,干预组的NGB值低于再灌注,(P<0.0l)。2.额叶皮质与海马CA1区p-ERK1/2的表达再灌注4-128h后,缺血再灌注组缺血侧额叶皮质p-ERK1/2阳性神经元呈现出先上升后下降的趋势,再灌注损伤后4h,缺血侧额叶皮层p-ERK1/2阳性神经元数量即显著增加(p﹤0.01),损伤后8h,p-ERK1/2阳性神经元数量继续显著增加(p﹤0.01),并在损伤后16h阳性细胞数量增加达到高峰。损伤后32-128h,p-ERK1/2阳性神经元数量明显逐渐减少,到128h后仍高于与损伤4h时阳性神经元数(p﹤0.01)。按损伤时间顺序看海马CA1区p-ERK1/2阳性神经元表达也呈现出先增加后减少的趋势,各时间点变化规律性与额叶皮质区再灌注损伤后各时点阳性神经元表达相似,但各时间点阳性细胞表达均较额叶皮质区为高(p﹤0.01).PD98059干预组在额叶皮质和海马CA1区p-ERK1/2阳性神经元变化趋势与再灌注组一致,但阳性表达的神经元明显低于再灌注组(P<001)。在不同区域再灌注组不同时间点p-ERK1/2阳性表达神经元数量非常显著高于干预组对应时间点阳性神经元数量(P<001),且两组各时间点阳性神经元表达有明显差异(P﹤0.01)。但皮质再灌注组4h与128h之间无差异(P>0.05)。根据各组均值,可认为在同一处理组的不同检测区域内,随缺血再灌注后时间的延长,p-ERK1/2阳性神经元表达增大.而在同一时间点,干预组的p-ERK1/2阳性神经元表达非常显著低于再灌注,(P<0.0l)。3.血清中的NGB含量变化从损伤后4h至损伤后128h,也呈现先上升后下降的趋势,各时间点与假手术组相比有显著性差异。经最小显著差数法两两比较检验发现,NGB血清含量128h时间点与1h时间点之间无显著性差异(p>0.05); NGB血清含量16h时间点与64h时间点之间无显著性差异(p>0.05);余各时间点之间有显著差异(p<0.01)。结论1.NGB阳性神经元表达增加与脑缺血再灌注密切相关,它对神经损伤后半暗区神经元的保护意义重大。2.p-ERK的表达增加是其对缺血再灌注的一种保护机制3.p-ERK信号转导通路可能是脑红蛋白一种上游调节机制。4.血清中NGB的增加有可能成为评价脑神经损伤的一种新的、可量化的指标,并可能在脑血管病早期诊断、治疗和预后评估中具有重要意义。