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糖尿病周围神经病变(Diabetic polyneuropathy,DPN)是糖尿病患者最常见的慢性并发症,可累及90％以上的糖尿病患者。随着糖尿病发病率的逐年上升,DPN的发病率也在不断增长。DPN发病隐匿,通常在严重累及感觉神经和运动神经,产生肢体麻木或疼痛、运动障碍、肌肉萎缩时才被发现,异常的疼痛、足部溃疡等症状严重影响患者的生活质量。
DPN的发病机制尚未完全阐明,明确参与DPN发病的因素包括神经微血管和血液流变学异常和多元醇通路活性增加,神经微血管血流障碍导致神经缺血缺氧引发神经功能和结构的损害；多元醇通路活性增高导致Na+/K+-ATP酶活性降低,胞内Na+和K+失衡,与神经功能障碍及神经形态学异常直接相关。P物质参与神经生长发育成熟,与DPN时神经功能和结构受损的恢复密切相关。
发病机制的不明确为DPN的治疗带来困难,国内外均缺乏特异性的治疗方法及药物。西医除控制血糖外,多采用镇痛药、维生素B12、血管扩张剂、抗氧化及补充神经营养因子等对症治疗,效果多不理想。近年来中药在治疗DPN方面取得了一些进展,并因其疗效肯定,副作用小而逐渐得到医学界的广泛关注。但是复方汤剂服用不便限制了中药疗效的发挥与广泛应用,因而需要有效治疗DPN的中成药物的出现。
JTT是集十余年临床经验,以补益肝肾、活血化瘀为治法的中药复方。其采取的治法有别于传统中医理论对糖尿病周围神经病变的祛风、活血化瘀、益气活血、益气养阴活血化瘀等治法。十余年的临床实践显示,其在减轻患者麻木、疼痛等临床症状,改善分度音叉振动觉、血液流变学指标及肌电图腓总神经感觉传导速度等方面取得了较好的临床疗效。
1目的
本实验旨在观察JTT提取物对糖尿病周围神经病变模型大鼠神经功能和神经损伤的干预作用,探索其可能的作用机制,为其临床应用提供药效学研究基础。
2方法
本实验采用链脉佐菌素(Streptozotocin,STZ)进行一次性腹腔注射诱导DPN大鼠模型。按血糖值筛选出符合成模标准的DPN模型大鼠后,将其按血糖值随机分为模型组、甲钴铵组、JTT提取物大、中、小剂量组,另取同鼠龄正常大鼠作为正常组。除模型组外,其余四组于造模1周后,分别以甲钴铵和大(12.6 g/kg)、中(6.3 g/kg)、小(3.2 g/kg)三个剂量的JTT提取物连续灌胃给药8周,并观察大鼠精神、活动、体重、血糖等一般状态的变化,给药8周(即造模9周)后测定坐骨神经传导速度用以评价神经功能,用免疫组化方法检测坐骨神经中神经肽P物质表达量,取胰腺观察其光镜下组织形态学改变,取坐骨神经观察其光镜下结构和电镜下超微结构改变用以评价神经组织形态学改变,测定坐骨神经钠钾ATP酶活性,并测定血液流变学指标进行综合评价。
3结果
3.1一般状态的研究
与正常组相比,造模1周后,模型组大鼠血糖明显升高(p<0.01),出现明显的消瘦、精神萎糜、活动减少、皮毛不荣等表现,“三多一少”症状明显,即多饮、多食、多尿、体重明显减轻(p<0.01),其尿液发出腐烂苹果的气味,以上症状持续到实验结束时。造模5周时,模型组部分大鼠出现烦躁不安,攻击性强,步态不稳等神经功能障碍的症状。
与模型组相比,各给药组大鼠血糖均未见明显降低,整个实验期间各给药组大鼠进食量、饮水量和尿量均未见明显减少,其尿液仍有腐烂苹果气味儿,但是其精神状态较好,未见大鼠精神萎靡。给药2周时,JTT提取物大剂量组体重下降即有明显改善,这种改善一直维持到给药结束。甲钴铵组体重下降的改善在给药7周时才出现。整个实验过程中,JTT大、中剂量组未见其出现烦躁不安,攻击性强,步态不稳等表现,甲钴铵组仍可见步态不稳的表现。
3.2神经功能的研究
与正常组相比,模型组大鼠坐骨神经传导潜伏期明显缩短(P<0.01),坐骨神经传导速度明显减慢(P<0.01)。与模型组相比,给药8周后,各给药组坐骨神经传导潜伏期均有不同程度的缩短,各给药组坐骨神经传导速度均有不同程度的提高。其中JTT大剂量组大鼠的潜伏期和坐骨神经传导速度接近正常,与模型组相比坐骨神经传导速度提高1倍,甲钴铵组大鼠坐骨神经传导速度提高约60％,JTT中、小剂量组坐骨神经传导速度分别提高45％和36％。
3.3组织形态的研究
采用变色酸2R-亮绿髓鞘特殊染色方法对坐骨神经进行染色,光镜下观查结果显示,正常大鼠坐骨神经横切面,有髓神经纤维密集、排列整齐,有髓神经纤维髓鞘呈现红色同心圆结构,提示髓鞘结构完整。模型组大鼠坐骨神经横切面,有髓神经纤维排列疏松紊乱,出现大量白色同心圆结构,提示髓鞘结构不完整或脱髓鞘改变。甲钴铵组大鼠坐骨神经横切面部分有髓神经纤维排列紊乱,可见少量白色同心圆结构,提示部分神经纤维髓鞘结构不完整。JTT大剂量组大鼠坐骨神经横切面,有髓神经纤维密集,排列整齐,偶见白色同心圆结构,提示大部分有髓神经纤维结构完整。JTT中、小剂量组大鼠坐骨神经横切面部分有髓神经纤维排列疏松、紊乱,可见白色同心圆结构,提示部分神经纤维髓鞘结构不完整。
经过图像分析软件对有髓神经纤维髓鞘面积平均光密度的半定量分析,与正常组相比,模型组大鼠髓鞘面积平均光密度明显减低(P<0.01)。与模型组相比,JTT大剂量组大鼠髓鞘面积平均光密度明显增加(P<0.01),甲钴铵组、JTT中、小剂量组大鼠髓鞘面积平均光密度也明显增加(P<0.05)。
采用透射电镜观察各组大鼠坐骨神经超微结构,结果显示正常大鼠坐骨神经的有髓神经纤维的髓鞘结构完整呈同心圆板层结构,髓鞘厚薄均匀,密度一致,雪旺细胞排列整齐,轴索无肿胀或萎缩,微管微丝分布均匀。模型组大鼠坐骨神经的有髓神经纤维的髓鞘结构不完整,板层结构分离明显,出现明显的脱髓鞘改变,雪旺细胞排列紊乱,轴突萎缩,被变性的髓鞘挤压成不规则型,轴突内微管、微丝分布不均匀。甲钴铵组大鼠坐骨神经的部分有髓神经纤维的髓鞘结构不完整,部分髓鞘板层分离,轴突萎缩形状不规则,轴突内微管、微丝分布不均匀。JTT大剂量组大鼠坐骨神经的有髓神经纤维的髓鞘结构完整,偶见节段性脱髓鞘,轴突轻度萎缩,轴突内微管、微丝分布较均匀。JTT中剂量组大鼠坐骨神经的有髓神经纤维的髓鞘结构较完整,可见节段性脱髓鞘,轴突轻度萎缩,轴突内微管、微丝分布不均匀。JTT小剂量组大鼠坐骨神经的有髓神经纤维的髓鞘结构不完整,可见节段性脱髓鞘,轴突萎缩,轴突内微管、微丝分布不均匀。对坐骨神经超微结构病变程度进行病理分级及秩和检验,结果显示甲钴铵和JTT大、中剂量能减轻DPN大鼠坐骨神经病变程度。
坐骨神经冰冻切片P物质免疫组化染色结果显示,模型组大鼠坐骨神经P物质表达明显降低,与模型组相比,JTT提取物大剂量组大鼠坐骨神经P物质明显升高。
胰岛HE染色光镜观察结果显示,正常大鼠胰岛结构完整,分布均匀,大小适中,DPN模型组大鼠胰岛数量减少,体积明显缩小。胰岛形状不规则,外周不整齐,部分动物的胰岛切片很难找到胰岛。甲钴铵组大鼠胰岛数量减少,体积缩小。胰岛形状不规则,个别动物胰岛结构不清楚。JTT提取物大剂量组胰岛数量仍然较少,部分动物胰岛体积较大,胰岛细胞有所增加。JTT提取物中、小剂量组胰岛数量仍然较少,体积较小,胰岛细胞较少,可见空泡变性。
3.4神经组织生化的研究
坐骨神经组织Na+/K+-ATP酶活性测定结果显示,与正常组相比,模型组大鼠坐骨神经组织酶活性明显降低(P<0.01)。
与模型组相比,甲钴铵组大鼠坐骨神经组织Na+/K+-ATP酶活性明显升高(P<0.05),JTT大剂量组大鼠坐骨神经组织Na+/K+-ATP酶活性明显升高(P<0.05),JTT中剂量组大鼠坐骨神经组织Na+/K+-ATP酶活性明显升高(P<0.01),较甲钴铵组更接近正常值,JTT中剂量组大鼠坐骨神经组织Na+/K+-ATP酶活性有增高趋势但无显著差异。
3.5血液流变学研究
血液流变学检测结果显示,与正常组相比,模型组大鼠高切变率(200/s)、中切变率(30/s)、低切变率(5/s、1/s)下的全血粘度均明显升高,血浆粘度明显升高,红细胞压积明显升高。与模型组相比,JTT大剂量组大鼠高切变率下的全血粘度无显著性差异,中、低切变率下的全血粘度明显降低,血浆粘度无明显差异,红细胞压积明显降低；JTT中、小剂量组大鼠高切变率下的全血粘度无显著性差异,中、低切变率下的全血粘度明显降低,红细胞压积有降低趋势但无显著性差异。
4结论
JTT提取物12.6g生药/kg能够明显提高DPN模型大鼠坐骨神经组织Na+/K+-ATP酶活性,明显提高其坐骨神经传导速度、降低血液粘稠度,减轻DPN模型大鼠坐骨神经组织的病理性损伤。
JTT提取物对实验性DPN的干预作用与降低血液粘稠度及提高Na+/K+-ATP酶活性、提高P物质表达有关。