论文部分内容阅读
本文概述了动脉球囊扩张血管成形术后再狭窄目前研究进展涉及发病机制及治疗措施。进而探索大鼠PCS基因转染对颈动脉球囊扩张再狭窄的治疗作用。首先根据已知大鼠PGIS基因序列自大鼠主动脉平滑肌细胞提取PCScDNA并用脂染法对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞进行PCS基因转染。显示PGIS基因转染可明显抑制平滑肌细胞增生。然后用家兔建立颈动脉球囊扩张损伤再狭窄动物模型。在此基础上对家兔颈动脉球囊扩张损伤再狭窄动物模型进行PCS转基因试验，结果显示PCS基因转染受损颈动脉能明显抑制新生内膜形成。
背景和目的心脑血管病是威胁人类健康的主要疾病之一。动脉介入治疗如球囊扩张和支架置入已成为治疗冠心病及颈动脉狭窄有力对策。而20-50％的再狭窄严重影响了其远期效果。有研究提示再狭窄由多因素引起，但主要与血管重新塑造，血管平滑肌细胞从中层向内膜移行并过度增殖密切相关。血管平滑肌细胞增殖是再狭窄的关键病因。虽然有些药物和装置能降低再狭窄率，但结果并不十分满意。需要探索新的治疗方法来进一步降低或根治再狭窄。对球囊扩张损伤血管壁的转基因治疗展示了光明的前景，将外源DNA序列转染特定部位的血管壁细胞，使其在局部表达能较长时间产生有生物性和治疗作用的蛋白质。
前列腺环素(PGI2)，一种花生四稀酸代谢产物由血管壁产生，并与PGI2受体结合，产生cAMP而发挥多种作用如扩张血管、抑制平滑肌细胞增生，抗血小板聚集等作用。前列腺素合成酶(PCS)能催化前列腺素H2(PGH2)生成PGI2。牛的PCScDNA已成功从主动脉内皮细胞克隆，其含有1500-bp开放读框编码-500-氨基酸多肽，分子量为56，628。Miyata等完成了人类从主动脉内皮细胞PCScDNA克隆，其编码一个500-氨基酸多肽。相继大鼠和小鼠PCScDNA被克隆，分别与人类PCS有84％和8％的一致性。对球囊扩张损伤的颈动脉进行PCS基因转基治疗再狭窄已成为可能，因此，我们构建了PCS表达质粒，检验内源性PGI2过度表达对新生内膜形成的抑制作用。本研究首先观察了PCS过度表达对培养的平滑肌细胞生长的抑制作用，再对家兔球囊扩张损伤的颈总动脉进行体内转染，以观察PCS基因转移对新生内膜的抑制作用。
方法：第一部分
1.PCS质粒DNA的制备：已知大鼠PCS序列(正向引物5-CATGTTCTGGGCCGCT-3，逆向引物5-GGAACAACAGGAAGT-CAGGAG-3，划线部分为启动密码子)，由赛百盛公司提供引物。取大鼠主动脉平滑肌细胞用改良Chomczinski和Sacchi方法进行细胞总RNA提取。用第一链cDNA合成设备对其进行逆转录。1.6Kb大鼠PCScDNA被克隆于pCMV形成pCMV-PCS。用LacZ基因替代PCS基因构建pCMV-LacZ作为载体对照。用质粒纯化设备对pCMV-PCS及pCMV-LacZ进行纯化。
2.取大鼠主动脉平滑肌细胞常规培养并用mouseanti-α-smoothmuscleactin(1：200)对平滑肌细胞进行免疫组化染色鉴定。
3制备质粒DNA阳离子脂质体复合物形成并对体外培养的VSMCs的转染。
4.分组：共分9组，空白对照组、pCMV-Lacz、pCMV-PCS分别在10μmol花生四烯酸+10％胎牛血清、10％胎牛血清、无血清条件下孵育。
5.用10％SDS-聚丙稀凝胶对VSMCs溶解产物进行免疫印迹分析，用化学发光反应物(Amersham)显色。
6.用酶免疫测定设备(EIA)对cAMP进行测定。
7.采用BrdU标记技术对VSMCs增生进行评价。BrdU指数按下列公式计算：DAB染色阳性细胞/苏木精染色的所有细胞。
8.统计分析方法：多组比较采用方差分析，两两比较采用q检验，p＜0.05为有显著性差异，结果用x±s表示。
第二部分
1.PCS基因体内转染选雄性家兔为实验动物，兔龄3个月，体重1.2～1.5kg。用25％乌拉坦耳缘静脉注射麻醉。颈正中线性切口暴露并游离右颈总动脉(CCA)、右颈内动脉(ICA)和右颈外动脉(ECA)。在右CCA近ICA、ECA分叉处近心侧约2cm处及右ICA起始处用动脉瘤直夹临时夹闭，在右ECA暴露的远心侧，距动脉分叉处约1cm处结扎。自耳缘静脉注射肝素钠(200IU/Kg)5min，自右ECA结扎处近侧穿刺进入导丝，在穿刺点近侧束以牛皮筋以备止血。取出CCA动脉夹，继续进入导丝，取出穿刺针，取出时为防止穿刺点出血，拉紧牛皮筋，在导丝引导下将2.0mm直径球囊导管经ECA至CCA入主动脉弓，然后将气囊充气。自主动脉弓向ECA后退，机械扩张右侧CCA，重复3次，每次30s，致右CCA内膜剥脱及机械损伤，撤出导管，束以牛皮筋止血。动脉夹原位夹闭CCA。
2.将实验动物分为4组：①空白对照组；②载体对照组注入pCMV-LacZ40μg；③pCMV-PCS-5组注入pCMV-PCS5μg；④pCMV-PCS-40组注入pCMV-PCS40μg。将100μlpCMV-PCS(5μg或40μg)或pCMV-LacZ脂质体复合物自ECA注入损伤CCA阶段，持续30min，然后拨出针头，结扎右ECA，去掉两端动脉夹，恢复血流，缝合创口，室温下标准混合饲料喂养。所有过程尽量在无菌环境下进行，术后青霉素20万U肌肉注射1/d，连续3d。
3.形态学分析于基因转染后第15天杀死兔子，取出右颈总动脉，福尔马林固定，常规石蜡包埋，HE染色，用显微镜和计算机分析系统分别计算新生内层层与是中层平滑肌层平均厚度的比值(I/M)。中层平滑肌细胞层的平均厚度。
4.统计分析方法采用方差分析和q检验。
结果：第一部分
1.在50μ110％胎牛血清10μmol花生四稀酸培养情况下，pCMV-PCS转染的平滑肌细胞表达的PCS蛋白是pCMV-LacZ转染细胞的2.1倍(n=5p＜0.01)。
2.在50μ110％胎牛血清10μmol花生四稀酸培养情况下，空白对照组、pCMV-LacZ组及pCMV-PCS组cAMP水平分别为6.8±0.7、7.5±0.4、17.3±0.5pmol/mg蛋白(n=5pCMV-PCS转染组高pCMV-LacZ组2.3倍p＜0.05，pCMV-LacZ对空白对照组无统计学意义)。
3.在10％血清刺激下，pCMV-PCS组BrdU指数明显低于pCMV-LacZ组及空白对照组(n=5p＜0.01)，pCMV-LacZ组低于空白对照组(p＜0.05)，无血清刺激情况下，PCScDNA转染对平滑肌细胞DNA合成没有影响。
第二部分各组一般情况经方差齐性检验方差齐。于转基因治疗第十五天，①空白对照组、②载体对照组、③pCMV-PCS-5组及④pCMV-PCS-40组I/M分别为：(1.20±0.14)、(1.24±0.15)、(0.6±0.12)、(0.140±0.05)，经方差分析各组间比较差异有高度显著性(P＜0.01)，经q检验①组和②组、①组和③组、①组和④组、②组和③组、②组和④组、③组和④组差异有高度显著性(P＜0.01)；中层厚度分别为：(0.12±0.07)mm、(0.14±0.08)mm、(0.13±0.09)mm、(0.12±0.03)mm,各组间差异无显著性(P＞0.05)。本试验提示PCS基因转移能显著抑制再狭窄。
结论本研究证明PCS基因转移可抑制血管平滑肌细胞生长，防治兔颈动脉球囊扩张损伤再狭窄。