论文部分内容阅读
肺癌的发生发展是多因素、多阶段、多基因改变共同作用的结果。以往研究认为,癌基因的激活和/或抑癌基因的失活是肿瘤发生的分子基础,它们通过促进肿瘤细胞的增殖和分化异常而导致肿瘤的发生。然而进一步的研究发现,肿瘤不仅增殖和分化异常,凋亡通路的异常在恶性肿瘤的发生中也很常见。细胞凋亡是机体重要的生理过程,起着维持内环境稳定的关键作用。凋亡调节紊乱有助于细胞的恶性转化和肿瘤的进展,是恶性肿瘤形成的重要机制之一。凋亡抑制蛋白是抑制细胞凋亡的重要成分。Survivin基因是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein IAP）家族的一个新成员,是具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白,在各种人类恶性肿瘤细胞中均有不同程度的表达。Survivin主要在细胞周期G2/M期表达,并与活化的Caspase-3和Caspase-7结合,抑制凋亡通路下游的汇集点,使Caspase超分子聚合体分离,从而抑制其活性,保护了关键的细胞周期调节因子如p21wafl,从而抑制了细胞凋亡。凋亡在正常情况下可以消灭DNA受损的细胞,即有恶变潜能的细胞。凋亡调控失调可以异常延长细胞的生存时间,促进有转化作用的基因突变的积累,并协助细胞逃避免疫系统的监视作用,从而参与肿瘤的发生。Survivin基因是一种新发现的凋亡抑制基因,其产物是IAP家族的成员。其组织分布具有明显的细胞选择性:在正常成人已分化的成熟组织（胸腺、生殖腺除外）不表达,而在人类多种肿瘤中有表达。目前反义抑制Survivin的合成主要通过以下几种途径:1、利用核苷类似物抑制Survivin合成;2、利用反义技术抑制Survivin活性,包括通过导入Survivin编码基因的反义DNA序列及mRNA序列,抑制其转录与合成;3、利用分化诱导剂抑制Survivin活性;4、利用拮抗剂减少Survivin复合物的生成,降低其活性。而通过克隆一段特定的反义cDNA序列（长度约20bp左右,通常为上游启动序列或核心编码序列）,干扰Survivin蛋白合成;5、利用小片段反义肽序列封闭Survivin基因表达,从而导致基因沉默治疗肺癌的方法,尚少见报道。本研究采用免疫组化方法检测Survivin、p16蛋白在非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）中的表达;选定人编码Survivin基因的核心模板区域（coding regions CDS）上游启动子序列（232-251bp）作为作用靶位,以人工合成并标记荧光蛋白的反义肽序列（aPNA）抑制此靶区,用脂质体共转染法将其转染肺腺癌A549细胞株,在倒置荧光显微镜下观察转染结果并进行鉴定,观察细胞生长情况,检测不同时间和浓度下细胞增值特性,用MTT法检测细胞存活率,流式细胞分析术检测各细胞周期的比例,并用MTT法检测不同时段脂质体转染aPNA组细胞与正常组细胞在加入一定浓度的顺铂下的生长情况;在此基础上,进一步采用RT-PCR、Western Blot、免疫组化等方法探讨脂质体转染Survivin aPNA后肺腺癌A549细胞周期基因p21及Survivin基因的mRNA和蛋白的变化。综上所述,本研究得出以下结论:1.NSCLC癌组织中Survivin呈高表达,与NSCLC患者的性别、病理类型无关,与分化程度、淋巴结转移与否及TNM分期相关;NSCLC中Survivin、p16蛋白表达呈正相关,二者在肺癌的发生发展过程中起一定的作用。2.Survivin aPNA能成功转染肺腺癌A549细胞,转染后可有效的抑制肺癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达,并可抑制P21基因的表达,阻止肿瘤细胞经过G2期进入M期,抑制肺癌细胞的生长,引发细胞凋亡。其抑制作用有时间依赖性和浓度依赖性。3.Survivin aPNA与顺铂联合作用,可增加肺癌细胞死亡率,有时间依赖性。