家蚕abdominal-A基因的克隆、表达及功能研究

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Abd-A基因是昆虫发育过程中的关键基因,最初在果蝇中发现。在果蝇中,abd-A基因参与调控腹节结构的产生、体节前后轴的分化、生殖细胞的迁移、生殖腺的发育、心脏的分化、神经系统发育,中肠形成和脂肪体的发育等众多生命过程。 Abd-A基因在物种间具有广泛的保守性。在果蝇中发现之后陆续在其他昆虫、吸虫以及高等哺乳动物等很多物种中发现其同源基因。家蚕是鳞翅目昆虫研究的典型模式生物,其胚胎发育研究具有重要意义。目前已报道了家蚕abd-A基因的两种mRNA的剪接形式,但对其功能的研究还未见报道。本研究克隆了家蚕的abd-A基因,对其在家蚕不同发育时期的表达进行了检测,并采用RNAi技术对其功能进行了初步研究,获得结果如下: 1 家蚕abd-A基因的克隆及特征在对家蚕基因组数据进行生物信息学分析的基础上,设计引物克隆了家蚕abd-A基因,其中包含全长CDS序列和部分3’UTR序列。结果表明,家蚕abd-A基因至少存在三种mRNA剪接方式,长度分别为1032 bp,1044 bp和1059 bp,分别编码343个氨基酸,347个氨基酸和352个氨基酸。其中,前面两种形式在NCBI已有报道,第三种形式为本研究新发现。三种剪接形式的abd-A基因都由3个外显子组成,所有的外显子/内含子边界均符合典型的CT/AC规则,差别仅在于第二外显子的大小。三种剪接方式的第二外显子的长度分别为33bp,45 bp,60 bp。物种间同源蛋白质序列的比对结果表明,家蚕ABD-A蛋白同其他物种中的同源蛋白具有较高的相似性,与红色面粉虫(Tribolium castaneum)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的相似性分别为67%和57%,而所分析的不同物种间的homcodomain序列高度保守,序列相似性约100%。 2家蚕abd-A基因的mRNA表达模式家蚕abd-A基因在受精后22h左右开始表达。且表达量逐渐增强:在蚁蚕中的表达量有所降低.这一表达模式与果蝇abd-A基因在胚胎发育过程中的表达模式非常相似.推测家蚕abd-A基因同果蝇abd-A基因的功能相似,在家蚕胚带的形成、腹节及中肠的分化等发育过程中起重要作用。同时家蚕abd-A基因在未受精卵内也有表达,推测abd-A基因在家蚕卵子发生过程中起重要作用。 abd-A基因在家蚕不同组织中的表达检测结果表明,abd-A基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、体壁、卵巢、精巢、马氏管、丝腺、血液、脂肪体、中肠中都有表达,这一结果说明abd-A基因在家蚕中参与多种组织的发育调控。3家蚕abd-A基因在胚胎发育期的RNAi研究本实验以正常N4蚕卵为注射材料,进行了abd-A基因的RNA干涉实验,结果表明,家蚕abd-A基因的表达被干涉后,发育的胚胎主要出现两种突变类型:Ⅰ型:腹足完全缺失,即第3~6腹节的腹足完全缺失。Ⅱ型:腹足部分缺失,即第3~6腹节的腹足出现部分缺失现象,这一结果表明家蚕abd-A基因在胚胎发育期能够决定第3~6腹节的腹足的正常生长发育。同时,进一步对RNA探针浓度对突变表型的影响进行了研究,结果表明,探针的浓度越高。注射的探针量越多,Ⅰ型(腹足完全缺失)突变表型的几率越高。总变异率高;反之,探针的浓度低,注射的探针少,Ⅰ型突变表型的几率越低,总变异率低,说明突变表型的产生有一定的剂量依赖性(dose-dependent)。推测不同突变表型的产生是由于abd-A基因的表达受抑制程度不同造成的。
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