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背景与目的:环状RNA(circ RNA)是一组3’和5’端结合在一起的共价闭合环形成的非编码转录本。Circ RNA如源自外显子,则形成外显子环状RNA;如源自内含子,则形成内含子环状RNA。他们还可以源自外显子与保留在外显子之间的内含子形成环形,被称为外显子-内含子Circ RNA(EIci RNAs)。也有一些证据表明,一些circ RNAs可以与RNA结合位点蛋白相结合,形成RNA-蛋白复合体调控其活性。例如,circ RNA可以与RNA聚合酶II和AGO蛋白结合。Circ RNA的含量也可以由包括Ago2介导裂解等Ago2依赖沉默机制所调控。就疾病相关性而言,circ RNA基因座中反义非编码RNA(c ANRIL)可以调控INK4/ARF的表达,从而增加动脉粥样硬化的风险。circ RNA与mi R-7结合,也可能与帕金森病和癌症的发展相关,但这需要进一步探讨。Circ RNA是否与肿瘤的发生发展有关?在前期实验中,我们筛查了多种circ RNA在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中的含量,发现circ-Amotl1(circular angiomotin like 1)在肿瘤细胞系中的表达明显高于非肿瘤细胞系。因此,本项目实验中,我们主要研究circ-Amotl1与肿瘤细胞恶性行为之间的关系。主要方法:首先,将circ-Amotl1载体和无序对照组载体,以及抗circ Amotl1 si RNA-1、si RNA-2和Olig转染转染入乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231,检测circ-Amotl1在体内外对乳腺肿瘤细胞生长的影响;接着,建立单一circ-Amotl1(circ-Amotl1-c)高表达细胞系,通过单细胞增殖试验、单细胞软琼脂克隆试验、单细胞动物试验等实验方法,进一步检测circ-Amotl1高表达对肿瘤生长的影响;最后,通过荧光原位杂交试验、免疫沉淀试验、Western免疫印迹试验、Northern免疫印迹试验等实验方法探讨circ-Amotl1促进肿瘤生长的机制,特别是circ-Amotl1与原癌基因之间的联系。主要结果:1.Circ-amotl1对肿瘤细胞生长的影响(1)人乳腺肿瘤标本中circ-Amotl1水平明显高于相邻正常组织。我们还检测了多种肿瘤细胞系(MCF-7,SK-Br-3,HTB-126,MDA-MB-468,MDA-MB-231,He La,JHH-1,and U87)和非肿瘤细胞系(Ha Ca T和MCF-10A),证实在肿瘤细胞系中circ-Amotl1表达水平明显高于非肿瘤细胞系。(2)我们将circ-Amotl1表达载体和无序对照组控制载体,稳定转染于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。实验证实,实验组细胞增殖能力和无血清条件下细胞生存能力显著高于对照组。实验组细胞在软琼脂克隆形成试验中形成较大克隆,在肿瘤细胞侵袭实验中表现出显著增强的侵袭能力。2.Circ-Amotl1促进肿瘤生长(1)我们在裸鼠皮下注射稳定转染circ-Amotl1表达载体和对照组控制载体的MDA-MB-231细胞。注射后17 d,大肿瘤被切除。此外,我们发现肿瘤组织和基底组织之间有粘连。H&E染色显示,肿瘤细胞广泛侵入周围肌肉组织和骨组织。重复上述试验,得到相同实验结果。通过肿瘤切片TUNEL染色,发现对照组肿瘤中死亡细胞比较多,而实验组肿瘤中几乎没有死亡细胞。CD34染色,实验组切片可见明显深染色的血管内皮影像,对照组不明显。另外,我们在实验组切片中发现骨组织内有肿瘤细胞和血管组织,从而导致骨组织被侵蚀,这种现象在对照组中没有发现。(2)为了更好理解circ-Amotl1成瘤性功能,我们从琼脂糖凝胶集落试验中选择单细胞形成的集落进行细胞培养,从而形成均匀细胞群体(circ-Amotl1-c)。这种做法可以提高细胞群体的均一性。单细胞增殖试验结果表明一个circ-Amotl1高表达的细胞10 d内可以增殖为11,250个细胞,是对照组细胞的30倍。实验组细胞的倍增时间是15到18 h,远高于我们已知的癌症细胞倍增时间。在单细胞软琼脂克隆形成试验中,接种后第12 d,实验组细胞数量是对照组的142倍。(3)为了进一步研究细胞的肿瘤形成能力,我们分别将单细胞培养在软琼脂糖胶中6 d(约219个细胞)、3 d(约9个细胞)形成的克隆接种在裸鼠皮下,同时,对照组细胞接种于裸鼠皮下。最终结果:6 d克隆组和3 d克隆组裸鼠均100%形成肿瘤,对照组没有形成任何肿瘤。(4)最后,我们在裸鼠背上接种单细胞:每次注射一个细胞。一些细胞在接种后20 d开始形成肉眼可见肿瘤。我们在180个接种点收集60个肿瘤。相对于单细胞接种转移预试验成功率约为80%,表明有41%单细胞接种后形成肿瘤。以上结果表明,每一个circ-Amotl1表达载体转染的细胞都有形成肿瘤的潜力。而其亲代MDA-MB-231细胞,需要1x107个细胞经过30 d才能形成肿瘤。结果显示,MDA-MB-231的致瘤性被circ-Amotl1的过表达重组为肿瘤激增细胞。最显著的特点是其快速增殖能力和全部细胞不分化现象。3.Circ-Amotl1促进肿瘤生长机制C-myc转录因子调控多种致癌基因表达,为了进一步研究circ-Amotl1高成瘤性现象机制,我们检测了circ-Amotl1和c-myc间的潜在联系。(1)为了证实circ-Amotl1可以下调c-myc表达水平,反之亦然。我们通过Northern免疫印迹法试验,检测c-myc结合circ-Amotl1的能力。当circ-Amotl1和探针的总输入相同,实验组与对照组相比较,链亲和素包被磁珠能够与实验组circ-Amotl1结合。反之,以此探针与c-myc进行试验,实验组中更多的c-myc被结合。(2)通过realtime-PCR试验分析了circ-Amotl1表达载体和对照组载体转染的细胞中c-myc目的蛋白含量,发现转染circ-Amotl1表达载体的细胞中c-myc目的蛋白含量增高。利用引物放大启动子分析circ-Amotl1在c-myc及其启动子之间互动的作用时,发现circ-Amotl1异位表达强化了c-myc与部分启动子(HIF-1,Cdc25a,ELK-1,and JUN)之间的结合能力。(3)将circ-Amotl1表达载体和对照组载体转染无c-myc细胞系HO15.19,验证c-myc对于circ-Amotl1功能的影响。虽然转然后的细胞中circ-Amotl1仍然显著高表达,然而细胞增殖试验中,实验组与对照组无明显差异,明确c-myc在circ-Amotl1实现功能中的重要作用。为了进一步验证上述结果,我们进行了circ-Amotl1沉默试验。我们采用针对circ-Amotl1的探针检测,circ-Amotl1被沉默后,circ-Amotl1 m RNA及c-myc蛋白表达水平显著下降。接着我们检测了c-myc结合蛋白,circ-Amotl1被沉默后这些蛋白表达也明显下调。(4)分别检测细胞核、细胞质中circ-Amotl1含量,发现相对于细胞质,细胞核内外来circ-Amotl显著高表达。沉默circ-Amotl1后重复Wester印记法试验,得到相反结论。共聚焦显微镜分析,对照组载体转染细胞内,c-myc主要分布在细胞质内,而circ-Amotl1表达载体转染的细胞中,c-myc主要分布在细胞核内。借助circ-Amotl1特异性探针,我们探测到circ-Amotl1和c-myc都大多分布于实验组细胞核内。沉默circ-Amotl1后,c-myc重新分布于细胞质内。综上所述,我们研究表明细胞内circ-Amotl1高表达可引起c-myc核易位。有研究表明c-myc在细胞核内易降解。而在我们的研究中,c-myc易位于细胞核内,而总量并未降低。这表明,在circ-Amotl1表达载体转染的细胞中,c-myc和circ-Amotl1共存于细胞核内,避免了c-myc被降解。结论1.乳腺癌组织中circ-Amotl1表达高于周围正常乳腺组织。2.Circ-Amotl1促进细胞增殖,circ-Aomtl1载体转染的MDA-MB-231细胞倍增时间约为16h,远高于对照组倍增时间26h,增殖能力强于目前已经发表的其他研究结果,且细胞增殖过程中不分化。3.Circ-Aomtl1促进细胞成瘤,circ-Aomtl1载体转染的MDA-MB-231细胞进行裸鼠成瘤试验,荷瘤鼠肿瘤生长迅速,5×106个细胞注射裸鼠,5d形成肉眼可见肿瘤,17d裸鼠不能负担肿瘤而被处死;3 d克隆(约9个细胞)、6 d克隆(约219个细胞)注射裸鼠试验,成瘤率100%;单细胞注射动物试验表明,单细胞即能形成肿瘤,成瘤率41%。4.高成瘤能力机制表现为,c-myc易位于细胞核内,circ-Amotl1可以阻止c-myc被降解,使得c-myc充分发挥致癌作用。