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前言心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是在缺血基础上恢复血流后,出现心肌组织细胞损伤加重的病理状态,并引起功能障碍及心律失常。急性心肌梗死后相关冠脉血管的再通过程是典型的缺血再灌注损伤过程。如何保护心肌避免再缺血和再灌注损伤,保护心肌功能,成为人们研究的重点。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素,它的作用已不仅仅局限于传统认为的促红细胞生成的作用,近期研究发现,它对缺血再灌注也有一定的保护作用。EPO对于缺血再灌注损伤后的心肌保护的机制复杂,目前尚未完全明确。随着EPO与IRI关系的研究进展和细胞保护机制的阐明,必将对PCI治疗后所引起的缺血再灌注损伤的治疗进展起到积极的推动作用。目的随着经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)已成为在急性心肌梗死治疗中的主要手段,由PCI所引起的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)也成为了研究热点。近年来随着对促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的深入了解,发现单次大剂量使用对心肌IRI方面也有保护作用,目前仅限于动物实验。本实验第一部分拟采用介入方法对猪冠脉进行球囊封堵制作IRI模型,此模型更接近临床急性心肌梗死进行PCI治疗,在此基础上检测IRI后的室性心律失常、左室功能、心肌坏死标记物及心肌梗死面积,观察EPO的IRI保护作用。随着对心肌IRI损伤研究的深入,越来越多的证据显示了以中性粒细胞浸润为主的炎症是造成心肌再灌注损伤的重要机制之一。肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素—6(IL-6)是参与炎症反应的重要介质,且以往研究表明在炎症反应中,核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)可调控以上两种细胞因子。在心肌缺血再灌注损伤过程中,及早诱导新生血管生成增加冠脉储备,促进侧枝循环发生也是保护心肌的重要方法。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factot-1,HIF-1)对缺氧状态下的血管生成起核心调控作用,通过影响其他生长因子的表达,而直接参与血管生成的全过程。在缺氧状态下,HIF-1α含量明显增加,蛋白激酶B(Akt)可增加HIF-1α的表达。大量研究证实EPO在体外可显著加快心内膜下内皮细胞生长。本实验第二、三部分以大鼠IRI模型为基础,使用EPO干预,就EPO对大鼠心肌IRI后炎症因子及HIF-1α的影响进行观察,并对其影响机制进行探讨。方法一、第一部分1、实验动物分组:将40只家猪随机分为假手术组、IRI组、缺血后EPO干预(EPO-1)组、再灌注后EPO干预(EPO-2)组,用球囊封堵前降支的方法制作IRI模型,EPO-1组于球囊封堵即刻5000U/Kg rhEPO腹部皮下注射,EPO-2组于解除球囊即刻5000U/Kg rhEPO腹部皮下注射。2、记录再灌注120min血流动力学参数,LVSP、LVEDP、dp/dtmax、dp/dtmin。3、记录室性心律失常的发生情况。4、检测再灌注120minCK及LDH的含量。5、摘取心脏,计算左心室梗死区与左心室质量的比值。二、第二、三部分1、实验动物分组:将40只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、IRI组、缺血后EPO干预(EPO-1)组、再灌注后EPO干预(EPO-2)组,用结扎冠脉前降支的方法制作IRI模型,EPO-1组于结扎即刻50000/Kg rhEPO腹部注射,EPO-2组于解除结扎即刻5000U/Kg rhEPO腹部注射。2、再灌注120min采静脉血使用ELISA方法检测TNF-α、IL-6。3、采血后迅速处死动物,摘取心脏,使用Western blot方法检测心肌组织中NF-κB、HIF-1α及Akt蛋白表达的变化,使用RT-PCR检测心肌组织中HIF-1αmRNA含量变化。结果一、第一部分1、与假手术组相比,IRI组各指标均有明显变化,P＜0.01。2、与IRI组比较,使用EPO干预后,其再灌注后血流充盈速度(P＜0.01)、左室收缩及舒张功能(P＜0.05)都有明显的增高趋势,而心肌坏死标记物(P＜0.01)及心肌梗死面积(P＜0.05)皆有明显的下降。3、与EPO-2组相比,EPO-1组降低心肌坏死标记物及缩小心肌梗死面积更明显,差异有显著性,P＜0.05。二、第二部分1、与假手术组相比,IRI组的TNF-α、IL-6、NF-κB水平明显升高,P＜0.01。2、与IRI组相比,使用EPO干预后TNF-α、IL-6、NF-κB水平有明显下降,有明显统计学差异,P＜0.01。3、与EPO-2组相比,EPO-1组的TNF-α、IL-6、NF-κB水平下降更明显,P＜0.05。4、NF-κB水平与TNF-α、IL-6含量呈正相关性。三、第三部分1、与假手术相比,IRI组HIF-1α的含量明显上升,P＜0.01,但Akt表达无差异性改变,P＞0.05。2、与IRI组相比,HIF-1α含量上升显著,且Akt也呈上升趋势,差异有显著性P＜0.01。3、与EPO-2组相比EPO-1组的HIF-1α及Akt上升更显著,P＜0.05。4、Akt与HIF-1α呈正相关性。结论1、EPO的干预可以有效减少IRI后的室性心律失常、改善左心功能、降低心肌坏死标记物及缩小心肌梗死面积;2、就降低心肌坏死标记物及缩小梗死心肌面积而言,缺血即刻的干预效果优于再灌注即刻干预,有利于临床实际的应用;3、EPO的治疗可通过降低NF-κB的途径降低IRI后血浆TNF-α及IL-6的水平来发挥IRI保护作用;4、缺血即刻的EPO干预的IRI保护效果优于再灌注即刻的EPO干预;5、EPO的治疗可通过提高IRI后HIF-1α及Akt的表达发挥保护作用;6、缺血即刻的EPO干预的IRI保护效果优于再灌注即刻的EPO干预。