犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因的原核表达

• 作 者: 孙鑫鹏
• 出 处: 宁夏大学
• 发表日期: 2020年02期
• 关键词: 犬细小病毒 VP2基因 鉴定 原核表达

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起犬的一种高度接触性的烈性传染病,临床上主要表现为肠炎型和心肌炎型。该病广泛分布于世界各地,近年来,病发率呈现逐年上升的趋势,给养犬业带来了极大经济损失。VP2蛋白是CPV的主要结构蛋白,也是CPV的主要抗原决定簇。本研究从1只患有犬细小病毒病的病犬粪便中分离出1株CPV,对其进行鉴定和VP2基因的原核表达。根据GenBank公布的CPV基因序列设计1对用于鉴定CPV引物,目的片段大小为1755 bp;参考文献设计鉴别犬冠状病毒(CCV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)的引物用于检测患病犬是否感染其他病毒;通过免疫荧光试验测定其半数细胞感染数量(TCID50)。结果显示用于鉴定CPV的引物扩增出的基因片段与预期大小相符;将目的基因与GenBank中收录的CPV-VP2基因进行遗传性与进化性分析,表明此基因与新CPV-2a型毒株GQ379042.1同源性最高,由此确定该株分离病毒为CPV,且为新2a亚型;其他病毒检测结果表明CCV、CDV、CPIV均为阴性;盲传5代时其TCID50为104.0/mL。将该株病毒的VP2基因连接至原核表达载体pET-32a,得到的重组表达质粒pET-32a-VP2,将鉴定正确的原核重组表达载体pET-32a-VP2转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。结果表明:目的蛋白的表达形式为包涵体沉淀,大小约为87kDa;对诱导条件进行摸索,当IPTG浓度为1 mM、诱导时间为4h、诱导温度为32℃时,蛋白的表达量最大;经Western blot鉴定,证明表达出的VP2蛋白具有反应原性。