毕赤酵母表达的两种植酸酶的分离纯化与表征及其N-糖基化研究

• 作 者: 许志宾
• 出 处: 福州大学
• 发表日期: 2004年01期
• 关键词: 植酸酶 分离纯化 表征 糖基化 结晶

本文是关于重组毕赤酵母（Pichia pastoris）高密度发酵的发酵液中两种植酸酶的分离纯化与表征、糖基化研究、结晶实验及其变性与复性的研究。使用CM-Sephadex C-50弱阳离子交换色谱分离技术，从基因重组的植酸酶发酵液中分离纯化出两种植酸酶，CMⅠ和CMⅡ，经SDS-PAGE和N－末端氨基酸测序鉴定，均为单一组分。植酸酶CMⅠ和CMⅡ分子量分别为55.3kD和53.1kD，二者作用的最适温度均为55℃，最适pH都是5.0，在37℃下CMⅠ的Km是0.42mmol/L，CMⅡ的Km是0.79mmol/L, Cu2+，Fe2+，Al3+和Zn2+对两种酶活性有较强的抑制作用，CMⅡ的酶比活力明显高于CMⅠ的酶比活力，两种植酸酶具有相同的N－端序列。用N-糖基化酶Endo H对两种植酸酶进行N-糖基化分析，CMⅠ相对含糖量为13.1%，CMⅡ相对含糖量为10.9%（分别以未去糖基的两种植酸酶分子量为对照），证实是糖基化的不同引起植酸酶CMⅠ和CMⅡ分子量的差异。分别测定去糖基后的酶活性，CMⅠ比活力降低为原来的81％，而CMⅡ比活力基本不变，CMⅡ比活力仍比CMⅠ高，表明植酸酶肽链糖基化会影响植酸酶活性，在一定糖基化程度下对植酸酶的活力起稳定甚至提高的作用。根据Crystal Screen配制了38种结晶条件进行两种植酸酶结晶尝试，确定了Crystal Screen中的第12号条件，即：30％ 2－丙醇，0.1mol/L NaHepes，0.2mol/L MgCl2，pH7.5作为结晶条件，其中CMⅡ得到晶体。改进H.D.Bae等报道用氯化钴做染色剂对植酸酶SDS-PAGE电泳胶染色，建立一种可以通过SDS-PAGE对比染色法特异检测植酸酶酶活性的新方法：SDS-PAGE结合硫酸亚铁－钼酸铵对比染色法。植酸酶在经过热、SDS-PAGE电泳完全变性后，仍能部分复性。利用SDS-PAGE对比染色法研究植酸酶的复性机理，发现Triton X-100和低温是植酸酶复性的关键，为蛋白质重折叠机制和蛋白质一级结构决定蛋白质高级结构提供了又一个证据。