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FADD(Fas-associated death domain),最早是作为细胞进行程序性死亡(凋亡)过程中的接头蛋白被人们熟识。细胞凋亡在众多的生理、病理条件下发挥不可替代的作用。当FADD的上游受体.配体(Fas-FasL)发生突变时(1pr/gld小鼠),凋亡信号无法转导,不同品系的小鼠都会发生不同程度的自身免疫性疾病。当FADD缺失时,这条凋亡通路也受阻。所以人们预测,FADD缺失的小鼠也会产生类似的自身免疫性疾病。然而,FADD敲除的小鼠死于胚胎发育的第10.5天左右,因此,人们利用条件敲除模型尝试在T、B细胞中敲除FADD。目前的结果是:在T、B细胞特异性敲除的小鼠中没有发生类似1pr或gld小鼠的那种自身免疫性疾病,却发现了FADD在T、B细胞发育中的作用。FADD的缺失或功能异常,都会阻滞免疫细胞的发育,使免疫功能受损。由此,关于FADD的非凋亡功能,开始被人们关注。目前,已发现FADD在细胞周期、细胞增殖及肿瘤发生中发挥功能。尤其是FADD-191Ser的磷酸化修饰,在各种生理、病理条件下,都发挥重要的调控功能。
为了研究FADD-19lSer磷酸化修饰在各种生理、病理条件下可能发挥的功能,我们选择了FADD-/-tgD(Ser191Asp)小鼠(内源FADD敲除小鼠、同时转入tgD(mFADD-S191D)模拟FADD的永久磷酸化,后文简称FADD(S191D)小鼠)作为研究对象,同窝的FADD+/-小鼠作为对照,开展实验。
在针对不同的组织和系统进行了研究后,我们发现FADD(S191D)小鼠的能量代谢平衡、精子发生、T细胞早期发育等生理功能都发生了重大变化。
FADD(S191D)这个小鼠模型最明显的表型特征就是瘦小。在对小鼠出生后不同发育阶段进行解剖分析后,我们发现:出生后4-6周时,小鼠腹腔内的白色脂肪组织不断减少;6-8周成年后,白色脂肪组织基本消失。另外,我们实验室已有细胞水平(MEF、MEF-FADD-/-tgD)的蛋白质组和芯片数据,显示FADD(S191D)和野生型FADD在脂质代谢上有很大的差别。综合分析,我们认为可以利用该小鼠模型进行胰岛素耐受方面的一些研究。
首先,我们用传统方法检测了小鼠的糖耐量,发现与同窝对照相比,FADD(S191D)小鼠能够更快的从血液中清除葡萄糖;然后,我们检测了一系列的小鼠血清学相关指标,发现FADD(S191D)小鼠血脂含量低、胰岛素水平略微上调及瘦素水平极低;通过检测有氧呼吸,发现FADD(S191D)小鼠能量消耗更大。这些指标暗示FADD(S191D)小鼠可能对胰岛素非常敏感。通过对小鼠肌肉组织的离体实验,我们证实了至少在肌肉组织中,FADD(S191D)小鼠胰岛素通路确实处于高度激活的状态,并且在胰岛素刺激后激活程度更高。
由此,我们首先想到检测胰岛素通路的负反馈抑制信号JNK通路。通常情况下,胰岛素通路激活后,JNK同时也被激活,然后磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物-1)中的Ser307:IRS-1由于Ser307的磷酸化,无法再与胰岛素信号通路中的相关蛋白相互作用,导致胰岛素信号通路受阻,实现负调控。
在对肌肉组织进行的试验中,我们发现与同窝对照相比,FADD(S191D)小鼠的JNK在没有胰岛素刺激时就已经处于较高的激活状态;在胰岛素刺激之后,同窝对照小鼠的JNK磷酸化水平正常上调,而FADD(S191D)小鼠的JNK激活水平却略显下调。
至此,我们认为胰岛素刺激后,FADD(S191D)小鼠JNK活性上调受阻应该是胰岛素敏感的原因之一。
由于脂肪的大量堆积导致的肥胖会诱发糖尿病等一系列的病症,但脂肪组织也是动物行使正常生理功能不可或缺的。
在小鼠的繁殖过程中,我们发现,FADD(S191D)小鼠高度不育,只能用FADD+/-tgD和FADD+/-交配方式拿到,得鼠率很低。从FADD(S191D)雄性成年小鼠解剖特征上看,睾丸很小;取附睾进行精子活力检测发现精子很少且活力很低,而且睾丸的HE病理切片显示,精子的发育明显受到影响。
雄性小鼠出生后,无法立刻产生精子,经过大概4周的发育才开始有成熟的精子出现。
我们取出生后四到六周的FADD(S191D)雄性小鼠及其同窝雄性对照,分别做TUNEL染色,发现在该阶段伴随着脂肪组织的消失,FADD(S191D)雄性小鼠睾丸细胞的凋亡加剧。这一现象,我们认为和脂肪的异常密切相关。
在对FADD(S191D)小鼠模型胰岛素耐受及其脂肪组织异常导致的症状进行研究的同时,我们仍然延续着FADD(S191D)小鼠胸腺T细胞发育受阻现象的研究。
在我们实验室已发表的文献中,明确指出,FADD(S191D)小鼠胸腺T细胞发育受阻于DN3期。
T细胞膜上表达的TCR(T cell Receptor)多数由α和β两条链构成。小鼠胸腺淋巴细胞在DN3期的发育过程中,最重要的事件是发生β重排、表达,然后转移到细胞膜上,和其它的膜蛋白一起形成pre-TCR。目前的研究已经表明,DN3期至少分为三个阶段:TCR-βnegative、DN3E、DN3L,其中后两个时期TCR-β已经表达在细胞膜上。当细胞处于DN3E阶段时,细胞体积小,处于“静息”状态(不发生大量增殖);当细胞处于DN3L阶段时,细胞大量增殖,体积变大。
我们对FADD(S191D)小鼠胸腺淋巴细胞进行了流式分析。流式分析的物理点图代表了细胞的体积大小(FSC)和折射特性(SSC)等物理性质。通过分析,我们发现FADD(S191D)小鼠胸腺淋巴细胞在FSC上有两群,和同窝对照相比多出了一群体积较小的细胞。这表明,在这群体积小的细胞中,90％以上的是处于DN期。根据我们已发表数据,这提示我们,这群细胞处于DN3E或更早时期。
处于DN3E期发育阶段的胸腺淋巴细胞由于TCR-β在细胞膜上的表达,形成了pre-TCR,细胞通过pre-TCR得到信号开始增殖,进入DN3L期。
FADD(S191D)小鼠胸腺淋巴细胞中这群体积较小的细胞能否在细胞膜上正常表达TCR-β呢?通过分析我们发现,正常小鼠的DN期细胞60-70％是高或中低水平表达TCR-β,约有30-40％不表达;在FADD(S191D)小鼠胸腺淋巴细胞中,只有20％高表达TCR-β、10％中或低表达,不表达TCR-β的高达65％。
根据以上数据,我们认为在胸腺淋巴细胞DN3期的发育过程中,FADD(S191D)突变阻滞了TCR-β在膜上的表达。在下一步的研究中,我们要确认FADD(S191D)突变是否会影响β链基因水平的重组,或者说影响β蛋白向细胞膜上的迁移。
以上有关FADD(S191D)小鼠的研究,是为了能够更深入了解FADD蛋白Ser-191磷酸化修饰的功能,为什么这样一个修饰会在动物水平产生如此巨大的影响:进而深入的理解FADD及其磷酸化修饰在动物的不同发育阶段、不同的组织和系统中所发挥的功能。最终,希望能够通过FADD实现对一些病理状态的干预或治疗。