论文部分内容阅读
过敏性疾病是由机体对外来抗原所产生的异常的免疫反应所引发的一系列相关脏器的疾病,主要包括荨麻疹,特应性皮炎、哮喘、过敏性肠炎及过敏性鼻炎等[1]。这些过敏性疾病中,以哮喘最为常见,虽然遗传因素,自身免疫力等因素在哮喘等过敏性疾病的病因学中发挥重要作用[2],但人们生活方式及生活环境的变化也是造成哮喘发病率上升的因素之一,尤其是抗生素等抗菌药的不合理使用被越来越多的研究者认为是导致哮喘发病率及患病率逐年递增的元凶之一[3]。人类的呼吸道作为与外界连通的通道,上、下呼吸道都是微生物栖息定殖的地方,随着高通量测序技术及呼吸道取样技术的发展,有研究发现不论是在肺中还是支气管中实际上都定殖着各种各样的菌群。己有大量研究表明,肠道菌群与肠道疾病关系密切[4],也证实肠道菌群与哮喘疾病有关[5],但越来越多的研究者认为呼吸道菌群也参与调控呼吸道疾病[6]。玉屏风散是出自于元代《丹溪心法》中补益卫气以固肌表经典名方,由黄芪、防风和白术组成,在过敏性疾病中得到了十分广泛的应用。其对哮喘的作用也可能与调节呼吸道菌群密切相关,但目前仅靠临床数据及文献的支持是远远不够的,因缺乏合适的呼吸道菌群紊乱的哮喘动物模型,使得深入的机制研究变得困难。本研究探讨分析了过敏性哮喘与呼吸道肺部菌群之间的联系,通过实验建立了呼吸道菌群紊乱哮喘小鼠模型,对玉屏风散提取物(简称YPFS)对哮喘小鼠菌群的调控机制进行了研究,以期从菌群调控角度为中药复方对呼吸道疾病的治疗提供新的研究思路。研究从以下几方面展开:1.考察呼吸道菌群紊乱对哮喘动物模型的影响,并对呼吸道菌群进行16SrRNA测序分析(1)探索建立抗生素联用(滴鼻头孢哌酮舒巴坦钠-盐酸万古霉素)呼吸道菌群紊乱哮喘小鼠模型(简称菌群紊乱哮喘模型),并移殖来自于健康小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)给造模小鼠,研究呼吸道菌群在哮喘中发挥的作用;(2)通过对空白组,哮喘模型组及菌群紊乱哮喘模型组小鼠的BALF进行16SrRNA(16S ribosomal RNA)测序,研究不同组间菌群构成及丰度的差异,根据文献对已知的测序结果中呼吸道中的优势及有害菌菌群进行统计筛选,作为下一步研究的基础。2.在菌群紊乱哮喘模型小鼠上考察YPFS的效应,并通过16SrRNA测序观察其对呼吸道菌群的作用(1)给予菌群紊乱哮喘模型小鼠YPFS,评价其效应;(2)利用16SrRNA测序,研究给予YPFS后对菌群紊乱哮喘模型小鼠的呼吸道菌群的影响,并通过测序结果结合文献筛选可能的有益菌及有害菌。3.相关紊乱菌的作用机制探索及YPFS的作用(1)研究菌群紊乱哮喘模型小鼠在滴鼻移殖了筛选出的菌群(铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAE,水生黄杆菌Flavobacterium FLA)后,评价这两种出菌在哮喘疾病中的作用;(2)将体外培养的PAE及FLA与16HBE(Human bronchial epithelial cells)进行共培养,研究它们在体外对上皮细胞连接蛋白如E-Cadherin,Occludin及TLR2(Toll-like receptor-2)受体通路的作用机制,研究YPFS对PAE导致的16HBE受损的影响,阐述YPFS通过调控菌群治疗哮喘的作用机制。研究结果发现:1.呼吸道菌群在哮喘中有重要作用,16SrRNA测序发现小鼠呼吸道菌群结构发生明显改变在实验室前期建立的HDM过敏性哮喘模型基础上,建立了小鼠滴鼻抗生素致呼吸道菌群紊乱哮喘模型,发现给予抗生素造成呼吸道菌群紊乱后,小鼠哮喘加重,包括肺及BALF中TH2细胞因子水平,血中EOS(Eosinophils)数量,血清中IgE(Immunoglobulin E)的水平,肺组织病理学检查等,而再给予正常小鼠BALF则能缓解哮喘。小鼠BALF的16SrRNA测序结果提示呼吸道菌群结构发生了改变,其中PAE及FLA变化明显。2.YPFS能缓解小鼠菌群紊乱哮喘表现,调控哮喘小鼠呼吸道菌群结构在抗生素哮喘模型小鼠上给予YPFS,发现其可使哮喘小鼠的症状得以缓解,经16SrRNA测序发现YPFS可使模型小鼠紊乱的菌群得到了恢复,说明YPFS具有调控哮喘小鼠呼吸道菌群结构的作用。3.PAE可加重哮喘,FLA能对抗其作用;其机制与影响TLR2通路,调节上皮细胞功能有关通过对测序筛选出的PAE及FLA进行研究,在菌群紊乱哮喘模型上,发现PAE可加重哮喘的发生,而FLA可明显缓解哮喘,同时可显著抑制PAE造成的哮喘加重;体外研究提示PAE能通过激活TLR-2,破坏上皮细胞连接蛋白如E-Cadherin及Occludin,进而导致TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)的生成增加。而FLA单独对上皮细胞未见明显影响,但能明显抑制PAE造成的上述变化。4.YPFS可抑制PAE导致的上皮细胞功能紊乱及TLR2受体通路的激活将YPFS与16HBE及PAE共培养,发现YPFS可以抑制PAE导致的上皮细胞连接蛋白的破坏,也可抑制PAE导致的TLR2及其下游蛋白的激活;提示YPFS通过抑制PAE对上皮细胞的影响,调控菌群结构而起到缓解哮喘的作用。研究结论:1.呼吸道菌群在哮喘中发挥重要作用,其中PAE通过激活TLR2通路,破坏支气管上皮连接蛋白,上调TSLP的水平而加重哮喘症状,而FLA可明显抑制PAE造成的上述影响。2.玉屏风散的抗过敏性哮喘的作用与调控哮喘小鼠呼吸道菌群密切相关,抑制PAE的致上皮细胞TLR2激活及功能紊乱作用是其机制之一。