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研究背景和目的：目前恶性肿瘤是疾病死亡的首位原因。细胞癌变、浸润和转移往往表现为细胞膜上糖蛋白或糖脂的改变,根据凝集素对糖及其缀合物高度专一识别的特性,可利用外源植物凝集素作为探针在分子水平上研究细胞恶变过程中膜结构的改变。本课题首先将红桂木凝集素进行辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素标记,然后进行凝集素组化染色,观察胃癌组织和胃正常组织中红桂木凝集素受体的表达差异,为探索肿瘤的发生发展机制以及红桂木凝集素在肿瘤诊断中的应用提供理论和实验依据。方法：一、分离纯化红桂木凝集素：参照本实验室常规分离、纯化红桂木凝集素的方法,将红桂木种子研磨,硫酸盐分级沉淀法盐析蛋白,采用Gal-Sepharose 6B亲和层析纯化蛋白,透析、超滤、冻干、储存。红细胞凝集实验检测红桂木凝集素活性。二、ALL-FITC和ALL-HRP的制备1.ALL-FITC的制备：(1)透析法制备ALL-FITC：将红桂木凝集素冻干粉配制成溶液,测定浓度,加入FITC,将溶液充分混匀,透析,测定偶联物F/P值。(2)固化法制备ALL-FITC：先将红桂木凝集素与Sepharose 4B固相吸附,再将FITC溶液滴入凝胶柱内,用Gal-PBS洗脱ALL-FIT C,测定该偶联物F/P值。(3)比较两种方法的F/P值。2.ALL-HRP的制备：ALL-HRP的制备：采用高碘酸盐氧化法制备,将HRP在高碘酸钠溶液中对乙酸缓冲液透析,再加入已测定好浓度的红桂木凝集素溶液,透析后避光保存。三、胃组织中红桂木凝集素受体的表达分析1.病例收集：收集32例胃腺癌癌变组织切片和25例胃正常组织切片。2.ALL-FITC染色：石蜡切片常规脱蜡水化,将ALL-FITC覆盖于组织上,避光孵育,复染DAPI,利用荧光倒置显微镜观察红桂木凝集素受体表达情况。3. ALL-HRP染色：石蜡切片常规脱蜡水化,将ALL-HRP覆盖于组织上,避光孵育,再用苏木精复染,DAB试剂盒显色,在显微镜下观察红桂木凝集素受体表达情况。四、ALL-Sepharose 6B的制备：将活化好的Sepharose 6B与ALL亲和吸附,封闭Sepharose 6B其余的活性基团,测定ALL-Sepharose 6B的凝血活性。结果：一、从红桂木种子中分离纯化得到红桂木凝集素,经红细胞凝集实验检测,凝集活力为29-211。二、透析法制备ALL-FITC的F/P值为0.758,固化法的F/P值为1.02,两种方法所制备的ALL-FITC用于石蜡切片染色均得到较好的效果。三、胃癌组织红桂木凝集素受体的表达观察1. ALL-FITC染色：正常胃组织经染色后在荧光显微镜下可看到较微弱的绿色荧光,胃腺癌切片在镜下可看见明亮的绿色荧光,蓝色细胞核分布在绿色荧光中,说明红桂木凝集素受体主要分布在癌细胞的胞浆内。胃正常组织和胃腺癌组织均有红桂木凝集素受体表达,胃腺癌组织阳性率为68.8%,胃正常组织阳性率为24%,两组受体表达差异有统计学意义(P=0.001),表明胃腺癌组织红桂木凝集素受体表达明显多于正常胃组织的。2. ALL-HRP染色：镜下观察胃正常组织轻微着染,胃腺癌组织则着染为棕褐色,受体主要分布在癌细胞的胞浆内,有些受体主要分布在癌细胞的一侧胞浆中,有的则散布在整个胞浆内,细胞核未见着染。胃正常组织和胃腺癌组织均有红桂木凝集素受体表达,胃腺癌组织阳性率为75%,胃正常组织阳性率为16%,两组受体表达差异有统计学意义(P=0.000.),表明胃腺癌组织红桂木凝集素受体表达明显多于正常胃组织的。四、偶联Sepharose 6B的ALL可使红细胞凝集,说明Sepharose 6B已成功偶联ALL。结论：一、固化法制备ALL-FITC优于透析法。二、本实验制备的ALL-FITC和ALL-HRP均可用于组织细胞红桂木凝集素受体的表达分析。三、红桂木凝集素受体在胃腺癌组织比胃正常组织表达明显增多,主要分布在癌细胞胞浆。四、本课题组制备的ALL-Sepharose 6B可用于下一步的糖蛋白分离纯化。