论文部分内容阅读
乙酰化修饰是细胞壁多糖上一种普遍的修饰形式，影响多糖的理化性质，对细胞壁的结构维持和植物生长发育至关重要，同时也是影响植物纤维生物质应用价值的重要环节。细胞壁多糖上的乙酰化修饰对于构建有功能的细胞壁高级结构极为重要，因而植物在不同发育阶段和组织器官中具有特定的乙酰化修饰模式。而植物如何维持特定的乙酰化修饰模式一直未知。近年来已在植物中发现了三类参与细胞壁多糖乙酰化修饰的酶，均定位于高尔基体上，能促进乙酰基转移到多糖上，证明乙酰化修饰发生在多糖合成过程中。但由于高尔基体定位的乙酰酯酶尚未被发现，对于该过程中是否存在去乙酰化修饰，以及去乙酰化修饰的调控机制如何仍不清楚。 我们前期鉴定到一个脆鞘和叶尖枯死的水稻突变体bs1(brittle sheath1)，图位克隆和序列分析表明BS1蛋白属于GDSL脂酶/酯酶家族。本研究围绕BS1的生化功能开展了一系列研究。发现bs1突变体中木聚糖乙酰化水平明显升高，核磁共振分析明确变异位点是木聚糖主链O-2位和O-3位乙酰基。酵母表达的BS1蛋白具有酯酶活性，并对乙酰木糖和内源木寡糖具有乙酰酯酶活性，符合酶动力学反应特性。进一步的核磁共振分析确定了BS1特异作用于木寡糖O-2和O-3位，是木聚糖主链的乙酰酯酶。结合之前的蛋白定位结果，我们的研究表明BS1催化的木聚糖去乙酰化反应发生在高尔基体中，正是要寻找的高尔基体定位的乙酰酯酶。 GDSL家族成员众多，推测该家族其他成员也参与了细胞壁多糖的去乙酰化修饰。通过生物信息学和表达分析，在水稻基因组中遴选出三个BS1类似(BS1L)蛋白，并针对它们利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术创制了相关的突变体，对一个候选蛋白BS1L1开展了较为深入的生化研究。bs1l1突变体株高略矮、株型披散。细胞壁成分与结构分析显示木聚糖中乙酰基含量升高，核磁共振分析发现乙酰基的变异位点较bs1不同，在木聚糖O-2位和O-3位的阿拉伯糖取代基上发现乙酰基修饰变异。一系列的生化实验表明，在酵母中表达的BS1L1蛋白具有酯酶活性，并对乙酰阿拉伯糖具有特异性酶活。而融合BS1氨基端（N端）和BS1L1羧基端（C端）的嵌合蛋白则对乙酰木糖具有特异活性，暗示GDSL蛋白的N端可能在底物识别中发挥重要作用。核磁分析进一步证实BS1L1能去除木聚糖O-2位阿拉伯糖取代基上的乙酰基。此外，BS1L1与BS1具有相似的表达模式，在富含次生壁的细胞中共表达，且存在蛋白互作。bs1 bs1l1双突变体表型更为弱势。因此，BS1和BS1L1均是木聚糖乙酰酯酶，分别作用于主链和侧链上，并可能形成蛋白复合体协同调控木聚糖乙酰化修饰模式。 本论文还对其他两个BS1L蛋白的生化功能进行了初步探索，证明BS1L2和BS1L3均定位于高尔基体上，具有酯酶活性。对通用底物不同的亲和性暗示其酶活性可能不同于BS1。而相关突变体材料具有矮生或发育异常等表型，暗示BS1L2和BS1L3是有功能的乙酰酯酶。 本研究首次发现了在细胞壁生物合成中的乙酰酯酶，为GDSL家族中大量未知功能蛋白的阐释提供了重要线索。木聚糖乙酰酯酶BS1和BS1L1的功能研究将有助于解析植物维持细胞壁乙酰化修饰模式的分子机制，并为水稻高产优质分子设计育种以及纤维生物质的利用提供理论依据和新的基因。