木聚糖酶产生菌的筛选及酶学性质的研究

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通过以粗制木聚糖和葡萄糖为碳源的刚果红平板的初筛以及进一步的发酵实验,从土壤中分离筛选获得了一株具有高产木聚糖酶能力的真菌,经过菌株菌落形态观察及28S rDNA测序鉴定为赭绿青霉(Penicillium ochro-chloron),实验室命名为:赭绿青霉Sp1。摇瓶发酵条件优化试验结果表明,该菌株的最适产酶条件为:2%(W/V)粗制木聚糖+0.5%葡萄糖为碳源,0.44%KNO3+0.06%蛋白胨为氮源,发酵起始pH为5.0,150 mL三角瓶装液量为40 mL,转速为220 r/min,28℃下培养72 h木聚糖酶酶活可达387U/mL。同时经试验证明该菌株对金属离子Zn2+、Cr2+、pb2+、Cu2+有较强耐受性。 将菌株Sp1发酵所得粗酶液,经过(NH4)2SO4分步盐析,切相流超滤,Macro-Prep High Q Support阴离子交换层析,Bio-Gel P-60 Gel凝胶层析,木聚糖酶被纯化了134.38倍,酶液活力回收率13.43%,纯化酶经SDS-PAGE凝胶电泳显示单一蛋白染色带,其相对分子量Mr为35.97 KD。纯酶最适反应pH为4.0,最适反应温度为55℃,在40℃,pH2.2~6.0范围内,酶活性稳定。终浓度为0.01 mol/L的Na+、K+、Zn2+对纯酶酶活有促进作用,分别使酶活提高了4%、18%、11.8%。而Mn2+、Fe3+、pb2+、Cr2+、Ca2+、Hg2+对酶活则无影响。在发酵液中分别添加了pb2+、Cr2+、Cu2+、Zn2+四种金属离子(广东韶关大宝山矿山污染土壤中富含的金属离子)。发酵96h,结果显示,在0.3%(M/V)pb2+,0.1% Cr2+,0.1% Cu2+,2% Zn2+浓度下四种金属离子对该菌株产酶无影响,表明菌株Sp1及其所产木聚糖酶对这些金属离子有较高的耐受性。同时对该纯化酶与纯燕麦木聚糖作用产物进行纸上层析实验,结果显示产物绝大部分为二糖及寡聚糖,基本无单糖出现,结合测得纯化酶的相对分子质量,可推断此纯化酶为内切木聚糖酶。
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