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细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte， CTL)在机体清除肿瘤细胞以及入侵病原体过程中发挥重要作用。近年来，如何有效激活机体抗原特异性CD8+T细胞一直是肿瘤及感染性疾病治疗性疫苗发展的重要方向。交叉提呈指抗原提呈细胞摄取，处理，并通过主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complexⅠ， MHCⅠ)类分子提呈外源性抗原（如肿瘤细胞抗原）给CD8+T细胞识别的过程。抗原交叉提呈是诱导抗原特异性CD8+T细胞激活的主要通路。交叉提呈的研究主要集中于树突状细胞(dendriticcell，DC)如何摄取，处理，提呈抗原。关于肿瘤抗原如何形成和提供给DC研究的较少，一般认为肿瘤抗原由肿瘤细胞被动的释放，而不是主动包装与分泌。本研究小组既往研究发现肿瘤细胞的自噬途径通过抗原的富集，包装和分泌而对交叉提呈起决定性作用。 自噬是机体用于保持稳态的过程，其基本过程包括将细胞浆成分隔离于双层膜中形成自噬小体，随后自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其中的细胞成分被溶酶体中的蛋白水解酶降解并进入再循环。胡红明课题组发现肿瘤细胞的自噬在肿瘤抗原交叉提呈中发挥重要作用，自噬小体可作为抗原的载体有效诱导交叉提呈。基于这些发现，其发展了一种叫做富含短寿蛋白的自噬小体（DRips in blebs，简称DRibbles）的新型肿瘤疫苗，主要由自噬小体组成。生理情况下，肿瘤细胞来源的囊泡很少包含泛素化蛋白，但DRibbles来自于蛋白酶体抑制剂及溶酶体抑制剂处理后的肿瘤细胞，包含了多种肿瘤细胞成分，包括长寿蛋白、泛素化短寿蛋白及废蛋白。DRibbles能够在体内外有效交叉激活抗原特异性CD8+T细胞，来源于小鼠肿瘤细胞的DRibbles能够治疗小鼠黑色素瘤、肺癌、乳腺癌及肉瘤。然而，既往DRibbles的相关研究均以小鼠为对象，DRibbles是否能有效激活人抗原特异性T细胞尚未可知。 针对以上研究现状和问题，本文评估了DRibbles是否可以有效激活人记忆性抗原特异性CD8+及CD4+T细胞以及作用的最佳条件;分选了人外周血单个核细胞中的DC亚群，比较各DC亚群提呈DRibbles功能的差异;采用GM-CSF/IL-4及GM-CSF/IFN-α体外诱导单核细胞分别生成IL-4 DC及IFN-α DC，比较了这两种体外培养DC提呈DRibbles,激活T细胞功能的差异。本研究将有助于阐明DRibbles的作用机制，研发基于树突状细胞及自噬小体的疫苗治疗肿瘤或感染性疾病。研究主要分为3个部分: 1.DRibbles诱导人外周血记忆性抗原特异性T细胞激活 目的:探讨DRibbles激活人抗原特异性T细胞功能。 方法:用表达巨细胞病毒(cytomegalovirus， CMV) pp65蛋白或者编码HLA-A2限制性CMV、EB病毒、流感病毒（cytomegalovirus、epstein-barr virus、influenza virus， CEF）抗原表位的质粒转染人胚胎肾细胞株HEK293T或者人肺癌细胞株UbiLT3，从这些能够表达病毒抗原的细胞中提取DRibbles或细胞裂解产物，将其负载至人单核细胞或PBMC并与自体T细胞作用，随后通过细胞内染色方法检测人CMV pp65或者CEF抗原特异性记忆性CD8+及CD4+T细胞反应。并且检测细胞因子GM-CSF、IL-4、IL-12、TNF-α、IFN-α-2b、IFN-γ，toll样受体(toll likereceptor，TLR)刺激物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Poly(I∶C)、M52-CpG、R848、TLR2配体以及CD40配体对DRibbles交叉提呈的作用。 结果:(1)与负载阴性对照HEK293TE6E7 DRibbles的单核细胞相比负载HEK293T CEF DRibbles的单核细胞能够激活更多的CD8+T细胞(2.40％ vs0.06％，P＜0.01)和CD4+T细胞(0.56％ vs0.03％，P＜0.05);在24例CMV血清学阳性供者的PBMC中，UbiLT3 pp65 DRibbles能够诱导0.24％的CD8+T细胞分泌IFN-γ，阴性对照UbiLT3 GFP DRibbles刺激组仅为0.08％(P＜0.01);在UbiLT3 pp65DRibbles刺激下，能够分泌IFN-γ的CD4+T细胞占总CD4+T细胞百分比为0.54％，阴性对照UbiLT3 GFP DRibbles刺激下IFN-γ+CD4+T细胞占总CD4+T细胞为0.04％，两组比较差异有统计学意义，P＜0.01;(2)与不加Poly(I∶C)组相比，Poly(I∶C)组中的UbiLT3pp65 DRibbles能够刺激更多的CD8+T分泌IFN-γ(2.99％ vs0.10％，P＜0.05);当采用Poly(I∶C)与CD40L共同刺激PBMC时，DRibbles激活PBMC中抗原特异性CD8+T细胞并不优于单用Poly(I∶C)组(P＞0.05); Poly(I∶C)与CD40L的加入并不影响 DRibbles诱导的CD4+T细胞反应(P＞0.05); CpG和LPS能够增强UbiLT3 pp65 DRibbles的交叉提呈，激活CD8+T细胞;然而R848（TLR7/8刺激物）及TLR2刺激物对增强DRibbles诱导的CD8+T细胞反应没有作用;(3) GM-CSF及IL-4的加入增加了UbiLT3 pp65 DRibbles诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应（3.71％ vs5.22％，P＜0.01），但不增加抗原特异性CD4+T细胞反应(2.53％ vs2.41％，P＞0.05);当IL-4从培养体系中去除后，DRibbles刺激出的pp65特异性T细胞反应没有明显变化;IFN-α-2b，IFN-γ，IL-1α，TNF-α不能增强DRibbles诱导的T细胞反应;(4)Western blots检测结果提示与细胞裂解产物相比，DRibbles中含更多的泛素化蛋白;细胞裂解产物与DRibbles中的CMV pp65蛋白表达没有明显差异;DRibbles中可见更多148KD高分子量的pp65蛋白条带，可能是泛素化的pp65蛋白;(5)在抗原终浓度为3μg/ml、10μg/ml、25μg/ml反应条件下，与细胞裂解产物相比，UbiLT3pp65 DRibbles能更有效的刺激CMVpp65特异性CD8+T细胞激活(P＜0.05);在诱导CD4(+)T细胞激活功能方面，DRibbles在低浓度条件下与细胞裂解产物类似，在高浓度条件下稍差于细胞裂解产物。 结论:包含病毒抗原（CMVpp65抗原或CEF抗原）的DRibbles可作为抗原载体在体外有效诱导人PBMC中记忆性病毒抗原特异性CD8+及CD4+T细胞激活;联合使用Poly(I∶C)、CD40配体及GM-CSF可增强DRibbles的交叉提呈。 2.人PBMC中各DC亚群交叉提呈DRibbles功能比较 目的:研究PBMC中各DC亚群交叉提呈DRibbles功能。 方法:采用NycoprepTM1.068分离液密度梯度离心PBMC，获取高密度细胞及低密度细胞，随后将低密度细胞通过流式细胞仪分选获取CD141+ DC、CD1c+DC、CD11c-CD141-细胞及单核细胞。同时，采用磁珠分选方法自PBMC中分选出CD8+及CD4+T细胞。通过细胞内染色方法检测上述分选获得的4群APC提呈UbiLT3 pp65 DRibbles，激活CMVpp65抗原特异性CD8+及CD4+T细胞功能差异。 结果:(1) NycoprepTM1.068分离液密度梯度离心PBMC能够富集PBMC中DC亚群于低密度细胞中。与PBMC相比，低密度细胞中CD141+DC比例增加6倍，CD1c+DC比例增加4倍，CD11c-CD141-细胞比例增加约3倍;(2)随着APC∶T比值增加，经过NycoprepTM1.068分离液密度梯度离心PBMC获取的高密度细胞及低密度细胞分别负载UbiLT3 pp65 DRibbles后能诱导更多的CD8+及CD4+T细胞分泌IFN-γ;与PBMC中的高密度细胞相比，低密度细胞负载UbiLT3 pp65 DRibbles后能诱导更多的CD8+及CD4+T细胞分泌IFN-γ;(3)在CD141+ DC、CD1c+ DC、CD11c-CD141-细胞及单核细胞中，Poly(I∶C)刺激后，CD141+ DC能最有效交叉提呈UbiLT3 pp65 DRibbles，诱导CD8+T细胞分泌IFN-γ。 结论:在Poly(I∶C)作用下，CD141+ DC是CD141+ DC、CD1c+ DC、CD11c-CD141-细胞及单核细胞中能够最有效交叉提呈UbiLT3 pp65 DRibbles，激活CMVpp65抗原特异性CD8+T细胞的APC。 3.两种体外培养的DC负载DRibbles后激活人抗原特异性T细胞活性比较 目的:比较IL-4 DC及IFN-α DC负载自噬小体疫苗后激活人抗原特异性T细胞的活性。 方法:体外培养人单核细胞获取IL-4 DC及IFN-α DC;制备表达CEF蛋白的HEK293T细胞，从中提取HEK293T CEF DRibbles;分别用IL-4 DC及IFN-α DC负载HEK293T CEFDRibbles后刺激自体T淋巴细胞，用细胞内染色方法检测分泌IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比;流式细胞术检测IL-4 DC及IFN-α DC表型差异。 结果:负载HEK293T CEFDRibbles的IFN-αDC能够诱导6.0％的自体CEF抗原特异性CD8+T细胞激活，而IL-4 DC只能诱导2.3％的抗原特异性CD8+T细胞激活，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);与IL-4 DC相比，负载HEK293T CEF DRibbles的IFN-α DC能够更有效的激活自体CEF抗原特异性CD4+T细胞(2.6％ vs0.3％，P＜0.05);与IL-4 DC相比，IFN-α DC细胞体积小，颗粒复杂程度低，表达较低水平的CD14、CD11c，HLA-DR的表达水平类似。 结论:与IL-4 DC相比，IFN-α DC负载HEK293T CEF DRibbles后能更有效激活人CEF抗原特异性CD8+及CD4+T细胞。