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Hepatocellular carcinoma related protein1(HCRP1)基因是由我们实验室发现的一个新的肝癌相关基因,由GenBank收录,收录号为AY033079。前期研究工作发现HCRP1基因在正常肝组织中有表达,而在肝癌组织中的表达明显下调或检测不到。RNA干扰技术抑制肝癌细胞BEL-7404中HCRP1基因的表达后,能促进细胞的生长和侵袭能力。后有文献报导HCRP1是内吞体分选复合体1(endosomalsorting complexes required for transport,ESCRT-1)的成员之一。复合体通过参与细胞内多泡小体的形成和膜受体蛋白内吞分选介导了膜受体蛋白的降解。然而,有关HCRP1肿瘤发生发展的关系及HCRP1在内吞分选中的作用及作用机制目前还很不清楚。
本论文第一章的工作研究了HCRP1对肿瘤发生发展的影响,我们利用免疫组织化学染色与组织芯片技术对HCRP1基因在肝癌组织中的表达进行了大规模检测,发现HCRP1在肝癌组织中表达明显下调或者缺失,HCRP1表达水平与肝癌发展进程呈现显著的负相关性,具有很好的临床病理学意义。我们构建了不同的HCRP1 shRNA表达载体,并建立了多种细胞的HCRP1 RNAi干扰稳定株。在此基础上,对HCRP1基因的功能和作用机制进行了进一步研究,发现HCRP1下调表达可以促进肝癌细胞BEL-7404和SMMC-7721细胞的生长和软琼脂克隆形成能力,并可显著增强BEL-7404细胞的裸鼠皮下成瘤性。通过低血清生长试验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下移植瘤模型首次发现抑制HCRP1表达可以诱导肝正常细胞和小鼠成纤维细胞恶性转化,此外,转化后细胞的侵袭能力明显增强。对HCRP1在细胞迁移和侵袭过程中的多种相关功能的研究发现HCRP1的作用非常广泛,可以影响细胞侵袭过程中的多个方面,HCRP1下调表达可以削弱细胞间粘附,增强细胞一细胞外基质间的粘附力,此外,HCRP1下调表达可以影响细胞骨架中F-actin分布,增加基质金属蛋白酶分泌水平及细胞膜整合素亚基表达水平等。为了进一步验证和探讨HCRP1发挥生物学功能和诱导细胞恶性转化可能的分子机制,我们采用Affymetrix人类全基因组寡核苷酸芯片杂交技术检测了HCRP1下调表达对细胞全基因组表达谱的影响,发现HCRP1下调表达可使许多与细胞增殖,凋亡以及运动有关的基因以及信号通路发生改变。我们利用实时荧光定量PCR对其中部分差异表达基因进行了验证,结果显示与芯片检测的信息有很好的一致性。
我们的研究表明,HCRP1的表达水平与HCC的发展进程呈现负相关性,其下调表达可以引起正常细胞的恶性转化,并影响细胞的迁移能力。HCRP1异常表达引起的基因组表达谱变化主要集中于细胞迁移和凋亡相关基因,提示HCRP1可能是肿瘤发生发展的负调控因子。
论文第二章的工作对HCRP1的重要生物学功能和机制进行了探讨和研究。通过对HCRP1 RNAi干扰QSG7701稳定株细胞和对照细胞进行细胞质膜组分和可溶性组分分离,对膜组分中内吞复合体关键蛋白TSG101水平进行Western blot检测,发现HCRP1降低表达可以减少膜组分中TSG101的水平。此外,HCRP1下调表达可以阻碍细胞中膜受体的降解效率,例如生长因子受体EGFP、PDGFR、c-MET。由此表明,HCRP1可以影响。TSG101蛋白与膜的结合并在膜蛋白受体内吞分选中起重要作用。HCRP1的细胞内定位研究发现野生型HCRP1呈胞浆弥散分布,而缺失突变体HCRP1(△152-1667则呈胞浆和细胞核的弥散分布,提示152-166区段是胞浆定位所必需的。过表达TSG101可以影响HCRP1的分布,后者从弥散分布转为点状分布。利用红、绿荧光蛋白分别标记HCRP1与TSG101,发现两者几乎完全共定位,表明TSG101和HCRP1的亚细胞定位是可以互相影响的。将胞浆定位信号缺失的突变体HCRP1(△152-166)与TSG101共转细胞发现,TSG101原本的点状分布变成了弥散分布,使其更多的分布于细胞核中,表明,HCRP1影响了TSG101的胞浆定位。由于TSG101与HCRP1的结合区域和TSG101与Tal相互作用的区域存在重叠,于是我们研究了HCRP1过表达对Tal与TSG101之间相互作用的影响,发现HCRP1过表达可以抑制Tal与TSG101之间相互作用从而保护TSG101以免其被Tal过多的泛素化而失活。
上述研究表明,HCRP1可以影响复合物核心蛋白TSG101的定位和功能发挥,并且在膜受体蛋白的内吞分选中发挥着重要作用。
总之,我们的工作第一次对HCRP1在肝癌发生发展过程中的作用进行了较深入地研究,由此发现了HCRP1的下调表达可以诱导正常细胞的恶性转化,并证明了HCRP1的表达水平在肝癌进程中的病理学意义。此外,在本研究中我们对HCRP1在膜蛋白受体内吞分选中的作用以及在复合物中对其它关键蛋白的影响也进行了较为深入的研究。我们的研究结果表明HCRP1是一个重要的肿瘤发生发展的负调控因子,它主要是通过影响细胞内吞分选的重要功能而发挥作用。