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阪崎克罗诺杆菌是一种食源性条件致病菌,它会导致不同年龄人群,特别是新生儿和免疫功能不健全的婴幼儿的疾病。这一致病菌的国家标准检测方法为传统培养方法,这一方法通常需要7 d时间,费时费力。基于聚合酶链式反应的分子检测方法虽然较传统培养方法极大地缩短了检测时间,且灵敏度高,但是需要昂贵精准的仪器设备进行检测,对操作人员的专业要求较高,因此不便于在条件有限的地区应用。在本研究中,我们将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与免疫层析试纸条(lateral flow strip,LF)相结合,建立了一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法。本研究对RPA-LF检测阪崎克罗诺杆菌的条件进行了优化,结果显示,RPA扩增的最佳条件为45℃的扩增15 min。灵敏度检测结果显示该方法对于纯培养的目标菌的检测限为1.7×102 CFU/mL,特异性分析结果显示,RPA-LF方法与其他常见病原菌没有交叉反应。用食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示增菌4h或6h后,检测限达到1.7×100 CFU/g。此方法对阪崎克罗诺杆菌的检测操作简单,可快速直观进行结果观察,而且有很高的特异性和灵敏度。该方法适用于资源环境有限的地区和食品企业进行阪崎克罗诺杆菌的快速检测。RPA被称为最接近“等温扩增”的方法,它可以在较低的温度下,在20 min内完成检测。本研究利用大肠杆菌重组表达系统,对RPA扩增所需的三种主要蛋白的基因进行重组表达,包括Bsu DNA聚合酶、T4 UvsX重组酶和T4 gp32结合蛋白。其中Bsu DNA聚合酶分子量约为64 kDa,最佳诱导条件为IPTG 0.05 mmol/L,在30℃诱导8 h,纯化后蛋白浓度可以达到0.26 mg/mL;T4 UvsX重组酶分子量约为43 kDa,最佳诱导条件为IPTG 0.005 mmol/L,在20℃诱导12 h,纯化后蛋白浓度可以达到0.27 mg/mL;T4 gp32结合蛋白分子量约为33 kDa,最佳诱导条件为IPTG 0.05 mmol/L,在30℃诱导8h,纯化后蛋白的浓度可以达到0.20 mg/mL,活性分析结果显示,重组表达的蛋白对于目标基因具有扩增活性。本研究的开展,对于阪崎克罗诺杆菌快速检测技术的发展以及RPA等温扩增技术在微生物快速检测中的推广应用奠定了良好的基础。