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研究目的:1、L929被TGF-β1刺激后miR-154的表达变化;2、过表达、干扰miR-154对L929生物学特性的影响;3、初步探索miR-154通过上调Wnt/β-catenin信号通路促进L929表型转化的分子机制。研究方法:1、TGF-β1刺激L929表型转化为肺肌成纤维细胞;2、将上述细胞分为5组:空白对照(Blank)组,干扰慢病毒空载体(sh-NC)组,过表达慢病毒空载(MCS-SV40-NC)组,干扰慢病毒(shmiR-154)组,过表达慢病毒(MCS-SV-miR-154)组分别转染肺肌成纤维细胞,构建过表达miR-154、干扰miR-154的细胞模型。3、q RT-PCR方法检测慢病毒转染5组细胞后miR-154表达情况;4、CCK8实验检测各组慢病毒转染后的细胞活力;划痕实验和Transwell实验观察各组慢病毒转染后细胞的迁移能力;流式细胞技术检测各组慢病毒转染后对细胞周期的影响;5、Western Blot、q RT-PCR检测5组细胞慢病毒转染后α-SMA、β-catenin、DKK2的蛋白、m RNA表达水平;研究结果:1、TGF-β1(5ng/ml/12h)刺激L929细胞,Western Blot结果显示α-SMA表达水平明显增加(P<0.05),成功构建了体外模型。2、荧光显微镜观察细胞转染效率的显示:慢病毒载体成功进入L929内。通过q RT-PCR检测miR-154的表达水平不同亦可证明已成功构建过表达miR-154、干扰miR-154的细胞模型。3、q RT-PCR方法检测各组细胞内miR-154的表达,分析其差异性,结果显示在空白对照组(Blank)、干扰慢病毒空载体组(sh-NC)、过表达慢病毒空载组(MCS-SV40-NC)内的miR-154的表达水平无明显差异性,而干扰慢病毒组(shmiR-154)的miR-154表达水平明显下调,过表达慢病毒组(MCS-SV-miR-154)的miR-154表达水平明显上调。4、细胞功能实验结果:(1)CCK8实验结果:空白对照组(Blank)、干扰慢病毒空载体组(sh-NC)组、过表达慢病毒空载组(MCS-SV40-NC)细胞增殖无明显差异,干扰慢病毒组(shmiR-154)细胞增殖明显下降,过表达慢病毒组(MCS-SV-miR-154)细胞增殖明显上升;(2)划痕实验以及Transwell实验结果:空白对照组(Blank)、干扰慢病毒空载体组(sh-NC)、过表达慢病毒空载组(MCS-SV40-NC)细胞的迁移速度无明显差异,干扰慢病毒组(shmiR-154)细胞迁移速度明显减慢,过表达慢病毒组(MCS-SV-miR-154)细胞迁移速度明显加快;(3)流式细胞技术结果:空白对照组(Blank)、干扰慢病毒空载体组(sh-NC)、过表达慢病毒空载组(MCS-SV40-NC)三者的S期细胞数量无明显变化,干扰慢病毒组(shmiR-154)S期细胞数量减少,过表达慢病毒组(MCS-SV-miR-154)S期细胞数量增加。以上结果可提示miR-154的表达水平的确会促进Wnt/β-catenin信号的传递从而加强肺肌成纤维细胞的生物学特性。5、Western blot以及q RT-PCR检测慢病毒转染细胞后β-catenin、α-SMA、DKK2的蛋白、m RNA表达结果:β-catenin、α-SMA蛋白、m RNA在干扰慢病毒(shmiR-154)组均表现下调,在过表达慢病毒(MCS-SV-miR-154)组表达上调。DKK蛋白、m RNA在干扰慢病毒(shmiR-154)组表现上调,在过表达慢病毒(MCS-SV-miR-154)组表达下调。三个蛋白、m RNA在空白对照(Blank)组,干扰慢病毒空载体(sh-NC)组,过表达慢病毒空载(MCS-SV40-NC)组表达无明显差异性。研究结论:1、miR-154在TGF-β1刺激L929的肺肌成纤维细胞中表达上调;2、阐明miR-154可上调Wnt/β-catenin信号通路促进L929的表型转化;