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百草枯(paraquat,PQ)是全球广泛使用的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂,对人畜具有较强毒性,主要表现为肺损伤,且存活人群中绝大多数患者存在肺间质纤维化。现有研究显示PQ中毒的机制主要有氧自由基损伤、炎症因子网络系统作用、对细胞膜损害等,其中炎症因子网络系统目前被认为与肺纤维化关系密切。超抗原(Superantigen,Sag)是一类具有超强T细胞活化功能的蛋白分子,超抗原小剂量时可引起T细胞的大量活化激活免疫系统,而大剂量时引起T细胞克隆无能和免疫抑制。金黄色葡萄球菌肠毒素C1(staphylococcalenterotoxinC1,SEC1)作为由金黄色葡萄球菌产生的一种典型超抗原,具有相对低毒的特点,并且大剂量应用时,可以抑制免疫反应,使机体处于免疫不应答状态。该特点使其有潜力应用于百草枯中毒的治疗,抑制机体免疫反应,进而减少全身炎症反应综合症(systemicinflammationreactionsyndrome,SIRS)及肺纤维化的发生。
实验目的：
利用基因工程技术对SEC1进行定点突变改造,构建增活减毒型突变蛋白,并将构建的蛋白应用于百草枯中毒的小鼠体内,探讨SEC1对百草枯中毒后的全身炎症反应综合征以及肺间质纤维化的影响。证明重组SEC1能够抑制体内炎症因子的释放,减少肺组织损伤,下调纤维化相关基因mRNA的表达,抑制肺间质纤维化。
实验方法：
1、SEC1增强减毒型突变体ST-1和ST-2的构建
(1)SEC1增活突变蛋白S-1和S-2的构建
①根据野生型SEC1的cDNA序列使用Primer5.0软件设计相应突变引物,针对SEC1分子的二硫环内氨基酸进行突变研究。②分别应用突变引物和端引物扩增出突变位点上游和下游的PCR片段,再以上述PCR片段为模板应用两条端引物扩增出整条secl突变基因。③将PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析④PCR扩增产物的胶回收⑤对PCR扩增产物进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定⑥构建重组表达载体:将上述经双酶切的突变基因PCR产物与经同样酶切处理的表达载体pET-28a以1:5浓度混合进行10℃过夜连接,重组质粒转化原核宿主,筛选阳性克隆的PCR进行基因测序。
(2)SEC1减毒突变体ST-1和ST-2的构建
①分别以含有S-1和S-2基因的质粒DNA为模板,通过突变引物以重叠PCR法,扩增获得各突变蛋白编码基因st-1和st-2,经Xhol和EcoRI内切酶消化后切胶纯化,与经同样酶消化的表达载体pET28a连接过夜,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,经测序后验证重组表达载体构建成功。②将测序结果正确的突变蛋白表达宿主菌株进行培养后破碎,破碎产物经结合上柱、杂蛋白漂洗和目标蛋白洗脱三个步骤处理后得到纯化的目标蛋白。③分别将纯化后的ST-1和ST-2蛋白以SDS-PAGE分离,半干转膜仪转移至硝酸纤维膜,以鼠抗His-tag抗体为一抗,碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗进行Westernblotting分析。
(3)小鼠脾淋巴细胞增殖水平的测定
以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液将脾淋巴细胞加入96孔细胞培养板;经过系列10倍稀释的SEC1、ST-1、ST-2分别加入上述各孔中,通过酶标仪以测定波长570nm、参照波长630nm条件下测吸光值。最后以增殖指数(ProliferationIndex,PI)表示增值能力,PI=实验组吸光值/阴性对照组吸光值。
(4)ST-1、ST-2致热毒性和催吐毒性的检测
2、ST-1对百草枯中毒后全身炎症反应综合征作用研究
BABL/c小鼠随分成6组:对照组:PBS溶液以5mL/kg体积浓度腹腔注射小鼠30min后予24mL/kgPBS灌胃;PQ染毒组:PBS溶液以5mL/kg体积浓度腹腔注射小鼠30min后予百草枯240mg/kg灌胃染毒;ST-1组:ST-1溶液以5mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予24mL/kgPBS灌胃;低剂量ST-1组:ST-1溶液以1mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予240mg/kg百草枯灌胃;中剂量ST-1组:ST-1溶液以5mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予百草枯240mg/kg灌胃染毒;高剂量ST-1组:ST-1溶液以10mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予百草枯240mg/kg灌胃染毒。
观察小鼠的生存时间。染毒后72h处死小鼠,取血和组织。检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IGF-1、PDGF及各组织超微结构变化。
3、ST-1对百草枯中毒致肺间质纤维化作用研究
将BABL/c小鼠,随机分成6组,分别给予下列处理:对照组(CK组):PBS溶液以5mL/kg体积浓度腹腔注射小鼠30min后予6mL/kgPBS灌胃;PQ染毒组(PQ组):PBS溶液以5mL/kg体积浓度腹腔注射小鼠30min后予百草枯60mg/kg灌胃染毒;ST-1组(ST-1组):ST-1溶液以5mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予6mL/kgPBS灌胃;低剂量ST-1组(低ST-1组):ST-1溶液以1mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予60mg/kgPBS灌胃;中剂量ST-1组(中ST-1组):ST-1溶液以5mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予百草枯60mg/kg灌胃染毒;高剂量ST-1组(高ST-1组):ST-1溶液以10mg/kg剂量腹腔注射小鼠30min后予百草枯60mg/kg灌胃染毒。
观察小鼠的一般情况,包括体重,摄食量,生存时间。染毒后1周,断头法处死小鼠,取肺组织。一部分肺组织行HE染色,观察肺组织形态学变化。另一部分组织行纤维化相关基因检测。
实验结果：
1、SEC1免疫增强型突变体ST-1和ST-2的表达纯化
利用定点突变技术首先将二硫环内部氨基酸102-106(GKVTG)位点突变为WWH和WWT,构建成突变蛋白S1和S2,以增强其免疫调节活性;在此基础上,将S1和S2的His118和His122位氨基酸突变为Ala,构建成突变蛋白ST-1和ST-2,经体外淋巴细胞增殖测定实验,ST-1、ST-2、SECI浓度在＜100ng/mL时促进淋巴细胞增殖;但当浓度＞100ng/mL时能够抑制淋巴细胞增殖。且在各个浓度下,ST-1、ST-2的活性与SEC1活性相比有显著性差异,且ST-1活性大于ST-2(P＜0.05)。
ST-1、ST-2突变蛋白的体内致热毒性通过新西兰大白兔作为实验动物模型进行检测。蛋白样品通过静脉注射实验动物,注射剂量为10μg/kg体重。实验结果显示在对实验动物的体温进行监测的时间里,阴性对照(PBS)在实验期间没引起实验动物体温的显著变化。ST-1、ST-2突变蛋白引起的热源活性与野生型SEC1相比有显著提高(图9,P＜0.01)。
催吐毒性研究中幼龄猫作为动物模型检测ST-1、ST-2蛋白的催吐腹泻活性。研究结果显示经腹腔注射后,在26到48分钟内,所有给药动物都有不同程度的呕吐和腹泻反应发生,两蛋白的毒性强度较野生型SEC1均有一定程度改善,其中ST-2蛋白的腹泻动物数最少,而ST-1蛋白的呕吐动物数最少,且呕吐和腹泻的潜伏期较野生型SEC1和ST-2蛋白滞后。显示出一定减毒改良效果。
2、ST-1对百草枯中毒后全身炎症反应综合征的作用
小鼠动物染毒实验结果表明,ST-1能够有效诱导免疫抑制的产生,进而降低PQ中毒后血清及组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IGF-1、PDGF的水平,减轻由PQ引起的全身炎症反应综合征,减少引起多器官功能损伤甚至衰竭的可能性;ST-1改善肺内Ⅱ型上皮细胞的破坏,减轻细胞器损伤。
3、ST-1对百草枯中毒致肺间质纤维化的作用
中剂量和低剂量的ST-1蛋白拮抗可有效提升因百草枯染毒造成的摄食量下降、体重减轻,提高小鼠存活率。ST-1能够下调PQ中毒后α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1mRNA水平。小鼠肺组织HE染色提示ST-1能够减轻肺间质纤维化程度。减轻Ⅰ型胶原和肺泡壁的破坏,减少成纤维细胞的诱导,最终减轻肺间质纤维化的发生。
结论：
1、本研究中我们构建了将二硫环内部氨基酸102-106(GKVTG)位点突变为WWH(S1)、WWT(S2),并对其生物学活性进行了研究,突变蛋白的体外刺激T细胞增殖活性有显著增强。
2、本研究在二硫环内部氨基酸残基突变基础上,将S1、S2的His118和His122突变为Ala,降低其致热性性和催吐活性。
3、经淋巴细胞增殖实验、致热毒性、催吐活性实验检测,ST-1较ST-2增殖活性高,致热毒性和催吐活性小,因此ST-1被选择应用于后续的动物研究中。
4、ST-1能够降低PQ中毒后血清及组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IGF-1、PDGF的水平,减轻由PQ引起的全身炎症反应综合征。
5、ST-1能够改善肺内Ⅱ型上皮细胞的破坏,减轻细胞器损伤。
6、ST-1能够中剂量和低剂量的ST-1蛋白可有效提升因百草枯染毒造成的摄食量下降、体重减轻,提高小鼠存活率。
7、ST-1能够下调PQ中毒后α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1mRNA水平。
8、小鼠肺组织HE染色提示ST-1能够减轻肺间质纤维化程度。
9、本研究在理论上可进一步在分子水平阐明百草枯中毒后导致肺纤维化的炎症反应过程的作用机制,并且为以SEC1改构蛋白ST-1为代表的超抗原用于治疗百草枯中毒导致肺纤维化提供一条新的可行之路。