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本实验通过筛选比较5株冬虫夏草菌种,获得液体发酵生产冬虫夏草腺苷的较佳菌株WX-CS。
研究了冬虫夏草WX-CS的摇瓶发酵培养基和培养条件。分别以蚕蛹粉水解液和花生粉作为发酵培养基不同氮源进行正交实验,确定出影响腺苷含量的主要因素,进一步通过响应面分析实验对蚕蛹粉水解液培养基进行优化,最后通过SAS软件进行岭脊分析。得到两种培养基:培养基A为葡萄糖2.0%,花生粉1.5%,麦芽糖1.0%,蚕蛹粉1.0%;培养基B为葡萄糖1.5%,麦芽糖0.8%,蚕蛹粉0.51%,蚕蛹粉水解液2.5%。培养基A发酵菌丝体腺苷含量低,但菌体干重大;培养基B发酵菌丝体腺苷含量高,菌体干重小。最佳培养条件为:起始pH6.0,培养温度22℃,摇瓶转速为150r/min,最佳培养时间84h。在上述条件下,培养基A和培养基B发酵菌丝体腺苷含量分别为1.507mg/g和3.001mg/g,菌体干重分别为40.26g/L和22.16g/L。
以培养基A进行了30L发酵罐放大实验,发酵罐培养条件:接种量10%,转速150-200r/min,通风0.5-0.8vvm,温度22℃,装液量20L,罐压0.05MPa。在此条件下发酵60h,核苷类物质紫外OD值0.959,腺苷含量为1.851mg/g,菌体干重达到39.89g/L。
在培养基B基础上,研究了不同预处理方法对腺苷含量测定的影响。采用热水浴浸提法时,最佳的工艺条件为:浸提溶剂为75%甲醇,料液比1∶5.5,浸提温度50℃,浸提时间90min。在上述条件下,测得腺苷含量可达3.683mg/g。
采用高压液相色谱法测定了冬虫夏草WX-CS胞内核苷类物质含量,培养基A发酵菌丝体腺苷含量为1.851mg/g、尿苷含量为3.263mg/g、鸟苷含量为2.322mg/g;培养基B发酵菌丝体腺苷含量为4.092mg/g;腺苷含量分别是药典规定的18.50倍和40.92倍。
最后测定了冬虫夏草WX-CS菌丝体中的其他有效成分,培养基A发酵菌丝体甘露醇含量为7.53%,SOD酶酶活为358.9U/g;培养基B发酵菌丝体测得胞内含有17种氨基酸,其中必需氨基酸含量占氨基酸总量的40.43%,甘露醇含量为6.75%,SOD酶酶活为515.4U/g;与市场现有产品进行了比较,培养基B茵丝体腺苷含量为金水宝胶囊的1.25倍,培养基B菌丝体腺苷含量也高于百令胶囊;甘露醇含量以百令胶囊最高,两种样品甘露醇含量与金水宝相当,SOD酶酶活以培养基B发酵菌丝体最高,其次是培养基A发酵菌丝体,酶活分别是金水宝的2.44和1.69倍,百令胶囊的1.91和1.33倍。
实验中发现使用不同蛋白酶水解蚕蛹粉得到的水解液作为发酵培养基,菌丝体胞内核苷类物质种类和腺苷含量均不同。蛋白酶Ⅰ水解液发酵得到胞内核苷类物质单一,主要为腺苷;蛋白酶Ⅱ水解液发酵得到胞内核苷类物质成分较多,菌丝体腺苷含量较蛋白酶Ⅰ水解液低。蚕蛹粉和脱脂蚕蛹粉以蛋白酶Ⅰ水解,水解液作为培养基成分发酵,得到菌丝体干重和腺苷含量也不相同,蚕蛹粉在上述两方面均高于脱脂蚕蛹粉。