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目的:随着生物钟节律紊乱病生理机制的逐步阐明,其与2型糖尿病发生发展过程的相关机制研究已经成为国际研发热点。有研究表明,时钟基因在机体葡萄糖稳态调节过程中扮演着至关重要的角色。但分子时钟调控节律性胰岛素分泌以及维持葡萄糖生理稳态的具体分子机制尚未完全明了。本研究主要对时钟调控家族核心成员Clock蛋白对胰岛素分泌调节的作用机制进行初步的探讨。方法(1)检测SD大鼠不同器官和组织中Clock m RNA表达水平。(2)q RT-PCR检测INS-1细胞中Clock m RNA节律性表达。(3)q RT-PCR及Western blot检测si RNA转染INS-1细胞后转染效率以及抑制Clock内源性表达后INS-1细胞胰岛素合成相关基因INS-1、INS-2 m RNA表达。(4)GSIS实验检测抑制Clock内源性表达后INS-1细胞胰岛素分泌的变化。(5)q RT-PCR检测INS-1细胞钙离子通道节律性表达。(6)q RT-PCR及Western blot检测抑制Clock内源性表达后电压依赖性钙离子通道m RNA和蛋白的水平。(7)荧光探针法检测抑制Clock内源性表达后细胞内钙离子浓度的变化。(8)CHIP以及Luciferase方法,从DNA-蛋白质结合水平检测INS-1细胞钙离子通道Cacna1c启动子区Clock蛋白的结合水平。(9)ELISA法检测抑制Clock内源性表达后细胞内c AMP的含量。(10)Western blot检测c AMP下游相关蛋白的表达。(11)构建慢性睡眠紊乱小鼠模型。(12)检测小鼠体重、IPGTT、空腹血糖、空腹胰岛素变化。(13)GSIS测定慢性睡眠紊乱对胰岛分泌的影响。(14)q RT-PCR检测小鼠胰岛时钟基因转录表达以及钙离子通道的表达。结果(1)时钟基因Clock在6-8周SD大鼠多种器官和组织中m RNA表达水平不同,其在脾脏中的相对表达量最低,在胰岛、肌肉组织中的相对表达量较高。(2)INS-1细胞中,时钟基因Clock及Bmal1 m RNA表达呈现明显的峰值和谷值,即INS-1细胞生物钟基因表达存在明显的振荡节律。(3)抑制INS-1细胞中Clock内源性表达后,胰岛素合成相关基因INS-1、INS-2 m RNA水平均未显示明显变化。(4)抑制INS-1细胞Clock内源性表达后,在2.8m M葡萄糖孵育下,基础胰岛素分泌无明显变化,细胞内胰岛素含量也无明显变化,而在16.7m M高糖刺激下胰岛素释放量明显减少。(5)钙离子通道Cacna1c、Cacna1d m RNA表达均呈现明显的峰值谷值,即钙离子通道Cacna1c、Cacna1d表达存在明显的振荡节律。(6)抑制INS-1细胞Clock内源性表达后,Cacna1c在m RNA及蛋白水平表达均显著减低,而Cacna1d的表达变化无统计学意义。(7)抑制细胞Clock内源性表达后,细胞内钙离子含量也明显减低。(8)CHIP结果表明,INS-1细胞在未经干预条件下,Clock蛋白可与Cacna1c启动子-444~-454区域位点相结合。抑制INS-1细胞中Clock内源性表达后,Cacna1c启动子区的Clock蛋白结合明显减少。另外,luciferase reporter gene结果进一步验证了Clock蛋白可结合于Cacna1c启动子区域并调控其转录表达。(9)抑制INS-1细胞Clock内源性表达后,在基础状态下,细胞内c AMP含量以及磷酸化CREB水平无明显变化,而在16.7m M高糖刺激条件下,细胞内c AMP含量以及磷酸化CREB水平明显减少。(10)慢性睡眠紊乱4周后,C57,C57+CSD,OB组小鼠体重分别增加22.92%,0.42%,26.16%,OB+CSD组小鼠体重减低0.17%。(11)慢性睡眠紊乱4周后,IPGTT结果显示,C57+CSD组小鼠在30min的血糖明显高于C57组,OB组小鼠血糖峰值明显后移,且在15min、30min、60min、90min的血糖均明显高于C57组。与OB组相比,OB+CSD组小鼠120min的血糖明显增高。测定FBG和FIns结果显示,C57组与C57+CSD组小鼠的FBG和FIns值均无明显差异;OB组与OB+CSD组小鼠的FBG和FIns值均无明显差异。(12)GSIS实验结果显示,与C57组相比,C57+CSD组体外胰岛胰岛素分泌减低;与OB组相比,OB+CSD组体外胰岛胰岛素分泌减低。(13)慢性睡眠紊乱4周后,与C57组相比,C57+CSD组小鼠胰岛时钟基因CLOCK、BMAL1、PER1、PER3m RNA表达分别下调45.0%,38.87%,26.81%,35.57%;NR1D1 m RNA表达上调45.45%;PER2、CRY1 m RNA表达无显著差异。与OB组相比,OB+CSD组小鼠胰岛时钟基因CLOCK m RNA表达下调28.85%;BMAL1、PER1、PER2、PER3以及NR1D1 m RNA表达分别上调109.94%、52.42%、26.84%、93.0%、36.72%,CRY1 m RNA表达无明显差异。与C57组相比,C57+CSD组小鼠胰岛钙离子通道Cav1.2 m RNA表达下调44.50%;Cav1.3 m RNA表达无显著差异;与OB组相比,OB+CSD组小鼠胰岛钙离子通道Cav1.2 m RNA表达下调41.50%;Cav1.3 mRNA表达无显著差异。结论(1)时钟基因Clock在6-8周SD大鼠中的分布具有组织特异性以及Clock及Bmal1表达在INS-1细胞中存在明显的振荡节律。说明INS-1细胞具有节律自主性。(2)时钟基因Clock对INS-1细胞胰岛素合成以及基础胰岛素分泌没有影响,其可能主要是通过影响高糖刺激下胰岛素颗粒的胞吐作用进而影响胰岛素分泌过程。(3)在INS-1细胞内钙离子通道Cacna1c、Cacna1d m RNA的表达存在明显的振荡节律,且其节律性与Clock以及Bmal1相似。以及Clock可能是通过结合于Cacna1c基因启动子区调控其转录表达,进而影响胰岛素的分泌。(4)Clock调控高糖刺激下胰岛素分泌的机制可能与c AMP/PKA信号通路有关。(5)慢性睡眠紊乱4周可使小鼠体重增加减少,在ob/ob小鼠上表现的更明显,慢性睡眠紊乱可导致代谢正常小鼠胰岛素分泌受损,而在代谢异常ob/ob小鼠中进一步加重,其可能与胰岛时钟基因紊乱有关,具体机制与钙离子通道Cacna1c表达减低有关。(6)睡眠障碍已经成为现代成人主要的健康障碍,是糖尿病的发生发展的重要原因之一。时钟节律调控与睡眠息息相关。通过阐明其中的相关机制,可以启示我们找到应对的措施,特别是推动靶向性治疗的进程。