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研究背景及目的：PA28γ(又称REGγ、11Sγ、PSME3)是一种蛋白酶体调节因子,它能结合到20S蛋白酶体的外环并促进小肽的降解,这个过程并不依赖蛋白的泛素化也不依赖ATP,这与PA700不同,后者是一种能识别并降解泛素化蛋白的大分子复合物。目前已经有证据证明,PA28y-20S蛋白酶体也能降解完整的蛋白分子,如HCV-core和SRC-3。这说明PA28y-20S蛋白酶体能参与重要的细胞调节过程。PA28γ是PA28(包括PA28α、PA28β、PA28y)三种同系物中最保守的一种,而且它主要定位在细胞核中,这与其他两种同系物主要定位在细胞质中不同,这可以认为PA28γ与其他两种同系物相比存在着不同的生理功能。目前对泛素—蛋白酶体通路的研究已较为深入并取得一些实质性进展,包括蛋白酶体抑制剂的药用研发和应用(如Velcade,雷公藤红素(Celastrol)等),但对泛素非依赖性—蛋白酶体途径的认识还有待深入。值得关注的是最新研究发现,PA28γ也能够降解完整的内源性蛋白分子,是新发现的蛋白酶体降解蛋白的泛素—非依赖机制途径上的一个重要蛋白酶体因子。细胞诱导分裂实验、PA28y基因敲除小鼠研究、以及RNAi干扰研究等均证实：PA28γ参与了细胞的转化和细胞周期的调控,PA28y在有丝分裂细胞及快速增长细胞中高表达(包括在快速分裂的甲状腺癌细胞中的高表达),而knockdown或knockout PA28y可降低细胞的生长速度、阻止细胞周期进入S期。一些实验室在对肿瘤凋亡蛋白相互作用蛋白筛选时意外发现B-Raf、MEKK3、FLASH(CASP8-assosiated protein2)、Daxx、RanBPM、PIASI等细胞凋亡相关因子均能与PA28γ相互作用。而Li研究组在研究乳腺癌细胞时首次发现并证明PA28γ能与癌基因SRC-3相互作用并在体内、体外降解这种完整的内源性蛋白(Cell,2006).随后的研究又发现了几个重要的PA28γ作用靶蛋白,如细胞周期调控蛋白P21、P16、P19(Li et al。, Mol Cell,2007; Chen et al., Mol Cell,2007), P53(Zhang, EMBO,2008),G结合蛋白受体(Nakahata N,2007)及泛素连接酶smurfl (FEBS Lett,2010)等。有研究表明PA28y可作为乳腺癌的潜在标志蛋白,它能促进乳腺癌细胞的生长(Med Oncol,2011).但研究发现小鼠和人不同组织的PA28γ的mRNA和蛋白水平不一致。最近的研究发现PA28γ参与了DNA损伤修复反应(cell cycle,2011)。这些最新的研究分析表明,PA28γ与肿瘤的发生发展,尤其在凋亡机制和通路上,具有十分重要的生物学功能,甚至有望成为肿瘤治疗的辅助药靶(增敏剂)(I Mao,Cell Mol Life Sci,2008;2005).鉴于PA28γ是一种核定位蛋白(这不同于其同系物PA28α、PA28β定位在胞浆),但在细胞有丝分裂期却弥漫整个细胞,我们推测：PA28γ的不同细胞定位对细胞不同时期有着不同的影响,与PA28γ对上述重要靶蛋白的精细调控密切相关。我们的前期研究初步验证了这一点：我们构建的胞浆定位表达截断体PA28γ KL03-15和PA28γ KL03-17与核定位表达截断体PA28γ KL03-3对HepG2和Chang细胞的生长起到了不同的作用(王穗海,硕士毕业论文,2008)。最新研究证实,PA28y的过表达与直肠结肠癌、甲状腺癌和肝癌的发生发展密切相关。对92例原发性肺癌,48例结肠癌,49例甲状腺癌和206例肝癌样本进行免疫组化鉴定,发现高表达PA28y的例数均超过50%。通过GEO数据库搜索和芯片验证平台选出与其相关基因,并验证了它可通过作用于p53、mcy通路等促进这些肿瘤的病理过程。肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤,包括原发性肝癌和转移性肝癌两种,原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,根据最新统计,全世界每年新发肝癌患者约六十万,居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。按肿瘤的形态可分为结节型、巨块型和弥漫型。原发性肝癌在我国属于高发病,一般男性多于女性。中国是乙肝大国,我国的肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来,丙肝病人也在逐渐增加,乙肝后也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上,占全球肝癌病人的55%,已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手,其危险性不容小视。虽然目前已有研究表明PA28y与细胞增殖、凋亡等重要的生物学功能密切相关,但它在肝癌细胞周期中作用机制及方式还需要深入研究。本项目通过酵母双杂交筛选与PA28γ相互作用的肝细胞蛋白,以研究其对肝癌细胞周期及细胞凋亡的影响的研究,探讨PA28y在肝癌的细胞周期及细胞凋亡的作用及机制。方法：通过酵母双杂交筛选与PA28y相互作用的肝细胞蛋白,并将阳性基因构建克隆表达载体以进行验证试验。1、设计可连接于PGBKT7载体的PCR引物,通过PCR扩增到得的PA28y基因；2、连接于诱饵载体pGBKT7,获得诱饵质粒pGBKT7-PA28y蛋白酶体激活因子酵母双杂交诱饵载体；3、将pGBKT7-PA28y转化到酵母菌株Y2HGOLD;4、与SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A培养基中培养,检测PA28y蛋白酶体激活因子在Y2HGOLD酵母菌株中的对报告基因有无激活作用及细胞毒性；5、western Blot鉴定PA28γ在Y2HGOLD酵母菌株中表达；6、将表达PA28y良好的酵母珠Y2HGOLD与含人肝细胞全cDNA的酵母珠Y187融合杂交,与DDO/X/A培养基中培养；7、筛选出蓝斑,培养于通过DDO/X/A培养基；复筛一次；8、T7引物扩增测序鉴定；9、构建阳性克隆表达载体；10、转染AGS细胞并通过western blot检测其表达情况。结果：成功构建通过pGBKT7-PA28y蛋白酶体激活因子酵母双杂交诱饵载体,western blot鉴定PA28y在缺陷型酵母菌株Y2HGOLD中表达,pGBKT7-PA28γ蛋白酶体激活因子酵母双杂交诱饵载体在Y2HGOLD中无自激活作用,酵母双杂交筛选到的阳性克隆有TXNIP, ZPR9, MAX, rarres2,GNPTG等。成功构建TXNIP和ZPR9表达载体,western blot结果显示传染了目的质粒的AGS细胞中有目的蛋白的表达。进一步文献分析表明,TXNIP, ZPR9, MAX, rarres2,GNPTG这些基因与细胞周期及细胞凋亡密切相关。如硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)在细胞增殖、凋亡、分化的过程以及肿瘤、应激性疾病的发生中具有重要功能。作为一个氧还反应的调节子,TXNIP能与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)相结合,下调Trx的表达,而Trx则在DNA的损伤及细胞凋亡机制中有着关键的作用。TXNIP基因是一个新的抑癌基因,它在人类乳腺癌、肝癌、肺癌等癌组织细胞中均表达下降,并且与肿瘤的转移相关。TXNIP的缺失可以促使肿瘤细胞的增殖和抑制细胞凋亡的进程。而在抗肿瘤机制中,TXNIP可通过参与细胞周期阻滞、低氧调节、影响NK细胞(naturalkiller cell,NK cell)发育等过程介导肿瘤的发生发展。有报道称c-Myc基因重要伙伴蛋白Max基因缺失条件下胚胎干细胞丧失多能性并发生细胞死亡的机制研究进展。c-Myc基因参与多种细胞过程,包括细胞周期调控,致瘤性转化和体细胞重编程为诱导多能干细胞。c-Myc基因也是一个重要的调节自我更新和胚胎干细胞(ESCs)全能性的调节因子。超过70%的恶性肿瘤细胞存在Myc基因的过度表达。Myc是一种转录因子,参与细胞生长调控的许多方面,包括细胞生长、增殖和凋亡等,其过度表达可导致细胞信号传导通路异常,引起细胞异常增殖。ZPR9属于锌指基因家族,此类基因是人体中最大的基因家族,它参与细胞分化、胚胎发育,并与许多疾病的发生相关。ZPR9可以作为蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶的小鼠38生理基板(MPK38)的底物,参与各种细胞反应,包括细胞周期,细胞凋亡,胚胎发育和肿瘤发生。GNPTG基因编码产物为N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶复合物的γ亚基。有研究证实葡萄糖胺可以通过抑制蛋白酶体的活性诱导细胞死亡,这过程与N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶及PA28γ的活性相关。结论：通过酵母双杂交,我们筛选得到TXNIP, ZPR9, MAX, rarres2,GNPTG等,这些蛋白与细胞的生长繁殖、肿瘤的发生发展有重大关系。为我们进一步开展体内外实验验证它们相互作用的情况以及具体作用机制,进而深入了解PA28γ对细胞生长的调节机制、乃至肝癌的发生发展影响和药物靶标的发现,提供了良好的线索和基础。