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地椒收载于1977版《中国药典》,为唇形科百里香属植物百里香Thymus mongolicus(Ronn.)Ronn.或兴凯百里香Thymus przewalskii(Kom.)Nakai 的干燥地上部分。地椒,别名地花椒、山椒、山胡椒,始载于《嘉佑本草》,在《证类本草》、《本经逢原》、《本草纲目》、《中华本草》、《新疆中草药手册》、《陕西中草药》、《陕甘宁青中草药选》等均有记载。其味辛,性温,有小毒,功能温中散寒,驱风止痛,主治吐逆,腹痛,泄泻,食少痞胀,风寒咳嗽,咽肿,牙疼,身痛,肌肤瘙痒等症。现代药理学研究发现地椒具有很好的抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抑制血栓形成、减轻过敏反应等作用。国内外对百里香属植物化学成分的研究,主要集中在挥发性成分,其中麝香草酚与香荆芥酚具有良好的抗菌、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。目前兴凯百里香Thymus przewalskii(Kom.)Nakai的化学成分研究未见文献报道,且药典中地椒药材的质量标准,迄今未收载薄层鉴别、含量测定项。为明确地椒药效物质基础,完善其质量标准,本课题对兴凯百里香Thymus przewalskii化学成分和地椒药材质量标准进行了研究,取得以下主要研究结果:1综述百里香属植物的研究概况本文系统综述了百里香属植物的品种与分布、化学成分、药理作用及质量标准的研究进展。文献研究表明,百里香属植物全球约400种,分布在非洲北部、欧洲及亚洲温带。我国有11种,2变种。百里香属植物中分离鉴定的化学结构类型包括:挥发油类、黄酮类、联苯类、萜类、甾体类、有机酸类、木脂素类及其他成分。药理活性主要包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制血栓形成等。2实验研究2.1地椒化学成分研究采用硅胶、反相硅胶C18、Sephadex LH-20、MCI等色谱填料对地椒药材(Thymus przewalskii)乙醇提取物进行系统分离纯化,得到29个化合物。利用现代波谱技术(UV、IR、MS、NMR、2D-NMR、CD等)结合理化性质,共鉴定了24个化合物,分别为:(2S)-5,6-二羟基-7,8,4’-三甲氧基二氢黄酮(1),(2S)-5,4’-二羟基-7,8-二甲氧基二氢黄酮(2),5,4’-二羟基-6,7-二甲氧基二氢黄酮(3),樱花素(4),香叶木素(5),石吊兰素(6),迷迭香酸甲酯(7),Xanthomircrol(8),SalcolinA(9),Salcolin B(10),槲皮素(11),苜蓿素(12),木犀草素(13),Gardenin B(14),咖啡酸(15),熊果酸(16),齐墩果酸(17),β-谷甾醇(18),蓟黄素(19),丹酚酸A(20),丁香酸(21),穗花杉双黄酮(22),芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(23),野黄芩苷(24)。其中化合物1为新二氢黄酮类化合物,通过CD谱确定其构型;化合物2为首次从天然产物中分离得到,并通过CD谱确定其构型。化合物3-24为T.przewalskii中首次分离得到,化合物2-4,6,7,9-12,14,20-23,为首次从百里香属中分离得到。2.2细胞毒性试验研究采用CCK-8法,对地椒(T.przewalskii)中分离到的4个二氢黄酮类化合物(化合物1-4)的抗肿瘤活性进行测定和评价。结果表明:4个化合物在50～150μM浓度范围内对人肺癌A549细胞有微弱的细胞毒活性,IC50值分别为135.6 μM、93.3 μM、113.9 μM和74.5 μM。提示这4个二氢黄酮可能不是地椒药材中主要的抗肿瘤活性成分。2.3地椒挥发性成分研究采用HS-SPME技术结合GC-MS分析,对不同产地地椒药材挥发性成分进行研究。采用L9(34)正交试验设计对样品量(0.5,1.0,1.5 g)、萃取时间(20,40,60 min)、萃取温度(60,80,100℃)、解吸附时间(1,2,3 min)等因素进行优化。实验明确了不同因素对实验结果的影响程度顺序为萃取温度>解吸附时间>样品量>萃取时间,并确定最佳的固相微萃取条件为:样品量1.0 g,萃取温度80℃,萃取时间60 min,解吸附时间2 min。以最佳实验条件,对16批百里香T.mongolicus Ronn.,4批兴凯百里香T.przewalskii Nakai的干燥全草进行分析。通过数据库比对,共鉴定出挥发性成分102 个,其中共有成分 10 个,分别为 1,6-Octadien-3-ol,3,7-dimethyl-、3-Cyclohe xen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)-、2,6-Octadien-1-ol,3,7-dimethyl-,(E)-、2,6-Oct adienal,3,7-dimethyl-,(E)-、Thymol、Carvacrol、(-)-Spathulenol、Bicyclo[7.2.0]un dec-4-ene,4,1 1,1 1-trimethyl-8-methylene-,[1R-(1 R*,4Z,9S*)]-、5,9-Undecadien-2-one,6,10-dimethyl-,(Z)-、Eucalyptol,其中以麝香草酚(Thymol)和香荆芥酚(Carvacrol)含量最高,占各自总挥发性成分的9.11%～34.49%和15.06%～55.48%,验证了麝香草酚与香荆芥酚是地椒的主要挥发性成分。同时,上述实验结果表明,不同基源、不同产地药材之间挥发性成分具有一定的相似性,麝香草酚与香荆芥酚均为主要的挥发性成分,其含量与药材质量的相关性有待进一步研究。2.4 UPC2测定地椒中麝香草酚与香荆芥酚含量首次建立超高效合相色谱(UPC2)方法对地椒主要活性挥发性成分麝香草酚与香荆芥酚进行含量测定。参照2015年版《中国药典》附录相关方法,对线性、精密度、准确度进行了验证,结果表明,麝香草酚在5.25～168.00 ng范围内线性关系良好(r=0.9998),加样回收率为87.44%～102.88%(RSD=2.40%),20批地椒药材中麝香草酚含量为0.066～0.246‰;香荆芥酚在6.28～201.00 ng范围内线性关系良好(r=0.9999),加样回收率为87.29%～91.78%(RSD=1.96%),20批地椒药材中香荆芥酚含量为0.090～0.616‰;该方法快速灵敏、准确、环保,为地椒药材的质量控制提供参考。2.5地椒质量标准研究采用薄层色谱法对地椒药材中迷迭香酸进行定性鉴别;采用HPLC法测定地椒药材中迷迭香酸含量;参照2015年版《中国药典》附录相关方法,对地椒水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物进行检测。结果表明:地椒药材的薄层鉴别特征性强,紫外光灯(365 nm)下,供试品色谱中,在与迷迭香酸对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;HPLC法测定迷迭香酸在3.44～3520.45 ng(r=0.9999)范围内线性关系良好,加样回收率为97.41%～103.47%(RSD=1.76%);20批地椒药材中迷迭香酸含量为2.10～15.40 mg·g-1,水分为3.90%～8.54%,总灰分为5.80%～16.30%,酸不溶性灰分为0.90%～8.00%,醇溶性浸出物为6.20%～11.20%。确定药材中迷迭香酸含量不得低于0.20%,醇溶性浸出物不得低于6.0%,水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得过10.0%、17.0%和8.0%。所建立的地椒药材定性和定量评价方法简单、准确、重复性好,可用于地椒药材的质量控制。综上,本文系统地研究了兴凯百里香Thymus przewalskii化学成分,采用柱层析法分离鉴定了 24个化合物,采用GC-MS鉴定了挥发性成分,并对主要的活性挥发性成分麝香草酚和香荆芥酚,以及活性非挥发性成分迷迭香酸进行了定性定量分析。本研究弥补了兴凯百里香来源的地椒药材化学研究的空白,补充完善了地椒药材的质量标准,为进一步的开发和利用该药材提供了物质基础和理论依据。