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目的:通过提取初生SD大鼠视网膜建立视网膜神经节细胞(RGCs)的原代培养模型并对其纯度进行鉴定,检测组蛋白去甲基化酶JARID1B在大鼠出生后RGCs发育过程中的表达,研究JARID1B在其发育过程中的变化;建立过表达JARID1B的RGCs细胞模型,初步探索其对体外培养RGCs存活的影响。为视功能恢复及视神经相关疾病的基础研究提供一种体外实验体系,并为JARID1B在RGCS发育及再生中起重要作用提供依据。方法:1.首先通过培育OX-7杂交瘤细胞提取含Thy1.1抗体上清液用于阳性筛选RGCs;然后选取成年SD大鼠雌性12只,雄性6只,2:1交配,选取出生7d(P7)以内的乳鼠,选用木瓜蛋白酶对其视网膜组织进行消化,制备RGCs细胞悬液,以巨噬细胞多克隆抗体对所得细胞进行初步筛选,再以山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗鼠IgG(H+L)+含Thy-1.1抗体上清液依次进行阴性、阳性选择,将所得RGCs悬浮后铺板于24孔细胞培养板(提前用鼠层粘连蛋白和多聚-D-赖氨酸预处理)中进行培养,培养72h后采用抗鼠Thy-1.1抗体通过免疫细胞化学方法鉴定其纯度。2.用Western Blots检测P6(出生6d)、P14(出生14d)、成鼠视网膜组织中H3K4me3蛋白的表达;分别提取P3、P6、P14、10W(出生10W)、20W(出生20W)大鼠的RGCs,利用qRT-PCR及免疫荧光方法检测JARID1B及其相关分子的mRNA及蛋白表达变化水平及趋势。3.利用Cumate-pLenti-JARID1B-SV40-GFP慢病毒质粒转染培育3天的P6 RGCS使其过表达JARID1B,空病毒载体组作为对照,观察其对体外培养条件下自然凋亡(或坏死)的RGCs存活的影响。4.本文采用SPSS软件进行统计学分析,均通过方差齐性检验,配对资料采用配对t检验,不同组间比较采用独立样本t检验,检验水准为0.05,P<0.05说明差异有统计学意义。结果:1.OX-7杂交瘤细胞培育结果良好,所提取出的上清液含Thy-1.1抗体浓度高,用于阳性筛选大鼠RGCs效益好,收益率达1.5万个细胞/视网膜,连续观察培养RGCs无污染等现象,且可长期贮存,易于推广。2.此抗体筛选方法培养出的RGCs生长良好,纯度较高,体外可存活9天;P3RGCs存活时间相对更长,高密度接种的RGCs形成的细胞间突起连接更多,死亡速度更慢。3.WB检测H3K4me3蛋白在大鼠视网膜发育的不同阶段(P6、P14、成鼠)表达无显著差异;qRT-PCR检测JARID1B的mRNA表达量在大鼠初生时随发育逐渐增高,在P14后的某一时间点到达高峰,至20W(老年期)下降;细胞免疫荧光检测其蛋白表达证实了转录水平与翻译水平的统一。4.以慢病毒作为载体使体外培养的RGCs过表达JARID1B,观察到体外培养条件下会自然凋亡(或坏死)的RGCs存活时间延长,同一时间点镜下存活细胞较对照组多,且形态更稳定。结论:1.通过培育OX-7杂交瘤细胞提取的含Thy-1.1抗体上清液用于大鼠RGCs阳性筛选效益好,易于推广。培养出的RGCs生长良好,纯度较高,P6 RGCs体外存活时间可达9d,可以用于进一步的基础研究。2.JARID1B很有可能参与了RGCs的分化、成熟、凋亡过程,在RGCs发育过程的不同阶段发挥着不同的作用;H3K4me3与JARID1B在RGCs发育中的相互作用需要进一步研究。3.JARID1B过表达可使体外培养的RGCs存活时间延长,并维持RGCs形态及轴突连接,显示了JARID1B在维持RGCs活性、抑制RGCs凋亡乃至促进RGCs再生方面的可能潜力。