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脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种常见的、致残率很高的疾病,给患者、家庭和社会造成很大的负担。而原发性脊髓损伤后的继发性损害所造成的更大范围的神经组织损伤是导致损伤后功能难以恢复的关键因素之一。因此,在治疗SCI时应该考虑到以下两点:第一,应积极的预防和最大限度地设法缓解继发性脊髓损伤,保护受损伤的神经元；第二,应尽早采取能够促进损伤神经轴突修复和再生的治疗措施。目前,SCI的治疗仍以手术为主。通过手术减压、固定、缓解受伤脊髓节段所受到的压迫,但结果并不尽人意。因此,在手术治疗基础上研发确有疗效的药物,以减少继发性损害是目前研究的热点,具有广阔的前景。
中药方药“髓复康”(Suifukang,SFK)是由黄芪、川芎、赤芍、红花、葛根和三七等8位中药组成,主要功效是益气生阳,活血通络,补肾生髓。自1984～2004年,我导师从行为学、病理组织学、电生理学、HRP神经束追踪、神经元和神经胶质体外培养、电镜亚细胞结构和基因蛋白表达等多方面,对SFK治疗大鼠实验性急性脊髓损伤(Acute spinal cord injury,ASCI)进行了较为深入的研究和探索。结果表明,该药不仅具有肯定的中枢神经元保护作用,而且也具有促进脊髓损伤组织修复与再生的作用。2005年国家自然科学基金立项资助本课题的研究,主要目的是系统而严格地检验SFK治疗恒河猴SCI的疗效和促进损伤脊髓修复和再生的作用,并进一步探讨其作用机理。
1目的:
通过观察中药髓复康对脊髓半横断损伤后恒河猴行为学、血液中自由基、脊髓病理组织学、与脊髓修复和再生的相关蛋白Nogo—A、GAP-43及Tau表达变化的情况,检验髓复康对损伤脊髓修复再生的作用。
2材料和方法:
14只健康成年雄性恒河猴,其中10只在无菌手术下造成第12胸髓(T12)右侧半横断损伤模型。术后随机分为两组,即SFK组(S组)5只,模型对照组(M组)5只。S组术后逐日灌喂SFK水煎剂,生药剂量为每次8.55g/kg(20ml),每日一次；M组灌服等量的生理盐水,另外四只为正常组(N)不做任何处置。在术后1d、7d、14d、21d和30d,分别对各组恒河猴的运动功能进行评分。术后30天,动物经麻醉后,从左心室取血2ml备用,检测SOD、MDA的变化。然后用4％多聚甲醛(0.01M PBS液配制,Ph7.2—7.4)经心脏主动脉插管灌注处死动物。取损伤部位的脊髓组织,进行HE、尼氏及髓鞘染色,观察病理组织学变化；采用免疫组化检测Nogo—A、GAP-43及Tau蛋白表达的改变；为进一步研究,采用原位杂交方法检测Nogo—AmRNA、GAP-43mRNA表达的变化。通过光镜观察脊髓病变部位病理组织结构的变化；利用3Y图像分析仪分析Nissle染色切片内正常神经元的数量及Nogo—A和GAP-43阳性细胞数；以及Nogo—A和GAP-43、Tau蛋白阳性表达物及其mRNA的平均光密度(optical density mean,OD)
3结果和结论
3.1髓复康对恒河猴脊髓损伤后运动功能恢复的观察
结果:术后1d,各损伤组运动功能明显降低,肌力为0。术后7d,两损伤组分值略有增加,S组得分高于M组,但两组比较无明显差异；术后14d、21d,两损伤组分值均有所增加,但S组增加更为明显,与M组比较差异显著(P<0.05),但仍明显低于N组(P<0.05)；术后30d,M组分值最低,与S组比较差异显著(P<0.05),S组分值继续增加,但仍低于N组,组间差异显著(P<0.05)。
结论:组成SFK的益气活血药可以加速脊髓损伤恒河猴运动功能的恢复,且疗效显著。
3.2髓复康对恒河猴脊髓损伤后血液中自由基变化的影响
结果:损伤后,M组SOD活性下降,而S组SOD活性明显高于M组(P<0.05),与N组接近；各损伤血液中MDA含量均上升,但M组升高更明显,与S组比较(P<0.05)。
结论:SFK能有效清除SCI后血液中过多的自由基,并能提高机体搞氧化能力,在一定程度上保护了脊髓损伤组织,减轻了SSCI。为修复和再生提供了有利的外部环境。
3.3髓复康对恒河猴脊髓损伤后病理组织学变化的影响
结果:(1)HE染色结果显示:S组脊髓损伤区面积小于M组,S组的脊髓损伤灶多局限在脊髓右侧,而M组的多累及对侧。
(2)尼氏染色结果显示:S组正常神经元的数量多于明显多于B组(P<0.05)；但仍少于正常组,且差异显著(P<0.05)。
(3)神经髓鞘染色结果显示:S组脊髓损伤灶内有一些神经纤维,在损伤灶邻区内神经纤维数量也明显多于M组。
结论:由益气活血药组成的SFK能减轻ASCI后的SSCI,使损伤灶面积缩小,且SFK具有神经元保护作用,能减轻损伤导致的脱髓鞘反应。
3.4髓复康对恒河猴脊髓损伤后Nogo—A表达的影响
结果:(1)免疫组化结果显示:正常恒河猴脊髓组织中有微量Nogo—A蛋白表达,损伤后Nogo—A阳性细胞数明显增多,与正常组比较差异显著(P<0.05),且Nogo—A蛋白阳性表达物平均光密度也明显上调,与N组比较差异显著(P<0.05)；髓复康治疗后,Nogo—A蛋白阳性细胞数明显减少,与M组比较有明显差异(P<0.05),其阳性表达物平均光密度也明显下调,S组与M组相比有明显差异(P<0.05)。
(2)原位杂交结果显示:脊髓损伤后,Nogo—AmRNA阳性细胞数明显增多,Nogo—AmRNA阳性表达物的平均光密度明显上调,M组与N组相比差异显著(P<0.05)；而S组Nogo—AmRNA阳性细胞数明显少于M组(P<0.05),Nogo—AmRNA阳性表达物平均光密度下调明显,与M组比较差异显著(P<0.05)。
结论:SFK对Nogo—A的表达有明显的抑制作用,从而为神经纤维的再生提供了有利内部微环境
3.5髓复康对恒河猴脊髓损伤后GAP-43表达的影响
结果:(1)免疫组化结果显示:脊髓损伤后,GAP-43阳性细胞数可明显增多,M组与N组比较有显著差异(P<0.05),同时M组GAP-43蛋白阳性表达产物平均光密度也上调明显,与N组比较差异显著(P<0.05)；S组GAP-43蛋白阳性细胞数量及其阳性表达物的光密度增加更为明显,与M组比较差异显著(P<0.05)。
(2)原位杂交结果显示:正常恒河猴脊髓组织中有微量GAP-43mRNA表达,脊髓损伤后诱导GAP-43mRNA表达升高,M组与N组比较差异显著(P<0.05)；髓复康干预后,使脊髓中GAP-43mRNA表达上调更为明显与M组比较差异显著(P<0.05)。
结论:SFK具有促进脊髓内损伤神经的修复和再生的作用。SFK可以促进损伤相应脊髓节段GAP-43的表达,促进神经功能的恢复。
3.6髓复康对恒河猴脊髓半横断损伤后Tau蛋白表达的影响
免疫组化结果显示:正常恒河猴脊髓组织中有Tau蛋白表达,损伤后M组Tau表达下降,与正常组相比,差异显著(P<0.05)；髓复康治疗后,Tau蛋白表达增高显著,与M组比较有明显差异(P<0.05)。
结论:SFK可能通过促进损伤相应脊髓节段Tau蛋白的表达,而促进神经轴突的生长。