论文部分内容阅读
植物体细胞由于其全能性能够分化形成有活力的胚状体的现象称为体细胞胚发生，是植物再生的常见方式。柑橘是世界上种植最广泛和最重要的经济果树之一，体细胞胚发生是柑橘一个重要的适应性特征，被广泛应用于离体种质保存和基于生物技术的遗传改良。然而，柑橘不同基因型的胚性维持与体细胞胚发生能力不尽相同，多年来人们试图从激素调节与基因调控等方面探讨柑橘体细胞胚发生现象的分子机理。近年来，随着小分子RNAs在植物发育中的作用被广泛揭示，miRNAs合成与作用路径的基因被认为是植物合子胚发生所不可缺少的，依据合子胚发生与体细胞胚发生过程在形态学与生理上的高度相似性，我们推测小分子RNAs介导的对其靶基因的调控作用对于植物体细胞胚发生也是必要的。为了揭示参与柑橘胚性维持与体细胞胚发生的小分子RNAs及其靶基因，本研究从具有强胚性的“伏令夏”甜橙的非胚性愈伤组织（NEC）、胚性愈伤组织（EC）和体细胞胚发生过程中发掘并鉴定了较全面的“小分子RNAs-靶基因”调控组合，分析了参与柑橘体细胞胚发生的小分子RNAs介导的调控概况。具体研究结果如下： 1.从柑橘EST序列中预测保守的miRNAs及其靶基因 利用miRNA公共数据库miRBase13.0中记录的来自24个植物物种（不包括柑橘）的1,894条 miRNAs比对NCBI GenBank数据库中收录的560,271条柑橘EST序列，鉴定了78条编码潜在的miRNA前体的柑橘EST序列，分别来自10个柑橘种和3个杂交种，编码来自29个家族的51条序列特异的成熟miRNAs。编码潜在miRNAs前体的柑橘ESTs中约1/3来自被逆境胁迫的组织，说明逆境是柑橘miRNAs表达的诱因之一。此外，通过搜索与这些miRNAs反向互补的柑橘unigenes和EST序列，预测了25个潜在的柑橘miRNA家族靶定的36个unigenes和77条ESTs。潜在的靶基因主要是转录因子，调控植物发育、代谢与抗逆等生物过程。为了验证这些潜在的miRNAs的存在，采用qRT-PCR检测了其中9个miRNAs在“伏令夏”甜橙组织中的表达，结果发现每一个miRNA都在某个器官/组织中特异地高表达，推测这些miRNAs可能分别参与特定器官的发育。其中miR156在胚性愈伤组织中表达极高说明它可能参与该组织的正常增殖过程。 2.10个保守的miRNAs及其靶基因的时空特异表达模式反映其在柑橘体细胞胚发生过程中的调控作用 检测10个保守的miRNAs及其靶基因在“伏令夏”甜橙的非胚性愈伤组织（NEC）、胚性愈伤组织（EC）和体细胞胚发生过程中的表达模式，并探讨这些miRNAs与柑橘体细胞胚发生现象的关系。这10个保守miRNAs在植物物种间序列保守，并经证实调控模式植物发育的多个方面。经预测，找到了其中6个miRNAs靶定的16个unigenes，并以5?RACE验证了其中15个靶基因被miRNAs介导剪切的位置。以定量RT-PCR检测了这16个靶unigenes在体细胞胚发生过程中的表达模式。保守的miRNAs及其靶基因在柑橘体细胞胚发生过程中表达的时空特异性，说明它们可能在体细胞胚发生的不同阶段起调控作用。miR156、168和171在体细胞胚诱导过程（E1-4）中高水平表达，表明它们可能在早期调控体细胞胚发生；miR159、164、390和397在球形体细胞胚（GE）中表达水平高，而miR166、167和398在子叶形体细胞胚（CE）中表达水平高，说明这些miRNAs并非在体细胞胚发生早期而是在后期调控胚的形态发生。miR164、166和397分别靶定的基因在非胚性愈伤组织（NEC）中的高表达说明它们可能参与该组织的离体增殖过程。 3.柑橘非胚性与胚性愈伤组织中小分子RNAs的发掘：microRNAs与siRNAs对柑橘体细胞胚发生的调控作用 深度测序“伏令夏”甜橙非胚性与胚性组织的小分子RNAs文库，结合已公布的甜橙基因组序列，鉴定了191个产生小分子RNAs的茎环结构。这些茎环结构释放了50个已知的和45个新的miRNAs、130个微型反向重复转座原件（MITEs）来源的siRNAs和94个其它茎环结构来源的小分子RNAs。从降解的mRNAs文库测序数据，鉴定了235个具有相位排列特征的小分子干扰RNAs（phasiRNAs），同时鉴定了195个被miRNAs、siRNAs及其它小分子RNAs介导剪切的靶基因。大多数miRNAs和siRNAs在‘伏令夏’甜橙胚性组织中的积累量不足可能释放了其对下游调控植物发育的靶基因（主要是转录因子）的抑制作用，以提供体细胞胚发生所需的能量与底物。离体培养造成类似逆境胁迫的环境诱导柑橘体细胞胚发生，也触发了一系列逆境反应。miR482d表达下调引起其下游触发产生phasiRNAs量减少，同时释放了对抗病基因家族的抑制作用。miR169b.1在胚性组织中表达下调则可能释放了对其靶定的NF-YA基因的抑制以促进体细胞胚发生。Northern杂交结果显示，17个表达水平高的miRNAs和siRNAs可分别归类为在胚性组织、生胚过程、球形体细胞胚和非胚性愈伤组织中偏好积累的小分子RNAs。此外，发现csi-miR164b和171c的表达水平与柑橘不同品种的胚性愈伤组织的体细胞胚发生能力正相关。保守度极高的miR156a/b、164、166和171在胚性组织中表达极高，推测其具有抑制下游胚成熟或胚后发育所需转录因子表达的功能，以保障体细胞胚发生过程的正常起始。 综上所述，该课题预测了柑橘不同基因型中保守的miRNAs及其靶基因；鉴定了柑橘非胚性与胚性组织中大量miRNAs和siRNAs及其介导剪切的靶基因；首次在柑橘（非）胚性愈伤组织中鉴定了phasiRNAs；提出了以下假设：1）miRNAs和siRNAs表达下调释放对靶基因的抑制以支持体细胞胚发生；2）几个高度保守的miRNAs通过抑制其靶基因表达以正常起始体细胞胚发生。该研究结果为未来进一步鉴定影响胚性和调控体细胞胚发生的“小分子RNAs-靶基因”调控网络提供了较全面、可靠的基本信息。本研究筛选的体细胞胚发生相关“miRNAs-靶基因”的功能验证已取得进展，未来有望从miRNAs介导调控角度深入探讨植物体细胞胚发生的分子机理。