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第一部分OGD损伤星型胶质细胞分泌IL-10抑制神经元凋亡目的:建立原代星形胶质细胞及原代神经元氧糖剥夺(OGD)模型,探讨两种细胞OGD损伤后IL-10的表达水平及其生物学作用。方法:原代培养星形胶质细胞及原代神经元,并建立这两种细胞的OGD损伤模型。利用Real-time PCR和ELISA分别检测OGD损伤的细胞IL-10 mRNA和蛋白表达水平的变化,同时以OGD未损伤为对照组。给予OGD的细胞进行外源性IL-10干预,通过CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC/PI试剂盒分别检测IL-10干预后的OGD星形胶质细胞的细胞增殖和凋亡情况;同时用钙影像技术和Annexin V-FITC/PI分别检测IL-10处理的OGD神经元细胞内Ca2+浓度变化及细胞凋亡情况。结果:(1)经GFAP或NSE免疫荧光鉴定,证实原代星形胶质细胞及原代神经元的成功培养,并在此基础上成功建立了体外OGD损伤模型。(2)Real-time PCR和ELISA方法检测发现,OGD损伤可诱导星形胶质细胞中IL-10的mRNA(P=0.026)及蛋白(P=0.032)水平显著增高;而神经元OGD组与未损伤组IL-10表达水平并无明显差异。(3)外源性IL-10可抑制OGD损伤神经元的早期凋亡(P=0.009)及晚期凋亡(P=0.002),激活胞内Ca2+的活性(P<0.0001);但对OGD损伤星形胶质细胞的增殖和凋亡均无显著影响。结论:(1)成功建立了原代星形胶质细胞及原代神经元的OGD损伤模型;(2)OGD损伤诱导星形胶质细胞旁分泌IL-10,抑制OGD损伤的神经元凋亡,激活胞内Ca2+的活性。第二部分OGD损伤诱导星型胶质细胞IL-10分泌的分子机制目的:探讨OGD诱导星形胶质细胞IL-10分泌的具体分子机理。方法:免疫荧光及Western blotting技术检测OGD损伤的星形胶质细胞中TLR2、NFkB p-p65的蛋白表达水平变化。Western blotting及ELISA技术检测si TLR2腺病毒干预后或NFkB抑制剂PDTC处理后的OGD星形胶质细胞中TLR2、p-p65、IL-10的蛋白表达水平变化。最后利用CHIP-q PCR技术检测OGD损伤的星形胶质细胞中p-p65在IL-10基因启动子区域的结合情况。结果:(1)与control组比较,OGD损伤的星形胶质细胞中TLR2(P=0.003)、p-p65(P=0.0001)蛋白表达水平均明显增高。(2)si TLR2腺病毒干预后的OGD星形胶质细胞中TLR2、p-p65、IL-10蛋白表达水平均较OGD+RFP组显著下降(P<0.0001)。(3)NFkB特异性阻断剂PDTC处理后的OGD星形胶质细胞中p-p65(P<0.0001)及IL-10(P=0.012)的蛋白表达水平显著低于PDTC未处理组,但TLR2表达水平两组间无显著差异。(4)CHIP-q PCR检测结果显示,OGD损伤促进星形胶质细胞中p-p65蛋白与IL-10基因启动子区结合(P=0.0008)。结论:OGD损伤诱导星形胶质细胞高表达TLR2,激活NF?B信号通路,促进p-p65与IL-10启动子区相结合,从而诱导IL-10的转录活性。