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唾液酸家族属于九碳的氨基糖类化合物，在动物和微生物体内广泛存在[1]。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是唾液酸家族中最重要的成员，在食品和医疗领域具有广阔的应用前景:Neu5Ac可以作为婴幼儿奶粉的添加剂，促进婴儿智力发育和提高免疫力;Neu5Ac还可以作为抗流感药物的合成前体，其衍生物在治疗Alzheimer症和艾滋病方面具有显著的疗效。由于传统的生物提取及化学合成Neu5Ac的方法产量低下且步骤繁琐，目前生产唾液酸主要采用两步酶法催化相对廉价的底物N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸合成Neu5Ac。本课题针对双酶催化法中限速酶N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活普遍较低的情况，从Corynebacterium glutamicumATCC13032中克隆了一条N-乙酰神经氨酸醛缩酶(CgNal)基因，将其在大肠杆菌E.coliRosetta(DE3) pLysS中成功表达后进行纯化及酶学性质研究，同时对其蛋白序列和二级结构进行比对，对其主要位点进行了研究。 本研究从CorynebacteriumglutamicumATCC13032中克隆了一条N-乙酰神经氨酸醛缩酶(CgNal)基因，以pET-28a(+)质粒为载体，以大肠杆菌E.coliRosetta(DE3) pLysS为宿主，成功构建重组质粒pET28a-CgNal并成功表达。它包含了939个碱基对开放阅读框并编码了312个氨基酸，这个序列与已知的来自于大肠杆菌E.coliK12的N-乙酰神经氨酸醛缩酶(EcNal)的相似度仅为23.7％，在大肠杆菌进行成功表达后，经过诱导剂浓度、诱导温度、诱导前菌体OD等条件的优化，重组大肠杆菌CgNal酶的酶活有了明显的提高，唾液酸合成方向的酶活高于来源于E.coliK12的N-乙酰神经氨酸醛缩酶EcNal的酶活。为了给Neu5Ac的生物催化过程的应用提供理论研究依据，本课题对重组大肠杆菌中的CgNal进行纯化，并对其酶学性质进行研究。利用pET-28a(+)质粒上的组氨酸标签进行镍柱纯化，在SDS-PAGE上显示为单一条带，酶蛋白的分子量约为32.7KD，其蛋白表达量很大，是EcNal蛋白纯化的5倍左右，EcNal的表达量一般在2-3mg/ml。CgNal催化反应的最适pH为8.5左右，最适反应温度为40℃，具有较高的热稳定性，CgNal的催化反应有三个底物，分别是N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和丙酮酸(pyruvate)，分别在pH7.5和pH8.5的时候测定其Km、Vmax和Kcat值，其Km值表明CgNal相对于所有其他来源的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，化学反应平衡更偏向于唾液酸的合成方向。此外研究了不同的金属离子和表面活性剂对CgNal的影响，在pH7.5和pH8.5的条件下影响略有不同，在pH7.5的条件下，Co2+、Mg2+和Ni2+能促进唾液酸的合成，在pH8.5的时候，TritonⅩ-100能同时促进反应的合成和分解方向，两种pH条件下，Zn2+、CTAB和SDS都有明显的抑制作用。 本研究采用CgNal和EcNal的纯酶进行催化。在以N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸为底物催化6h以后，CgNal在pH8.5时Neu5Ac产量达到194.3g/L，转化率高达78.6％。相对于CgNal，EcNal在催化了12小时以后在达到最高产量59.9g/L，其转化率仅为24.1％，远远低于CgNal。将不同来源的N-乙酰神经氨酸醛缩酶和二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS)进行蛋白序列和二级结构的比对，同时做了系统发育进化树的分析。CgNal与EcNal一致性为23.7％，与Haemophilus influenzae Nal一致性为22.8％，与E.coli DHDPS的一致性为26.4％，与Corynebacterium glutamicum ATCC13032DHDPS的一致性为22.9％。比对结果发现，CgNal的底物识别位点残基与其他Nal略有区别，EcNal的识别位点均为，Asp191、Glu192和Ser208，而CgNal为Glu198、Thr199和Gly215，建立系统发育进化树对酶的同源性进行分析，发现CgNal属于DHDPS的家族。同时探究了DHDPS和Nal的底物特异性，发现EcDHDPS虽然对Nal底物有反应，但不适合作为Nal来催化ManNAc和丙酮酸生产Neu5Ac，而CgNal对DHDPS底物也有反应，但是它能很好的催化ManNAc和丙酮酸生产Neu5Ac，因此对其DHDPS底物识别位点进行定点突变，发现突变后的CgNal对DHDPS底物的利用率并没有提高。