氧糖剥夺对神经元线粒体的影响及红景天苷保护作用的研究

• 作 者: 张倩颖
• 机 构: 华中科技大学
• 出 处: 华中科技大学
• 发表日期: 2019年12期
• 关键词: 氧糖剥夺

实验目的：
　　研究氧糖剥夺模型（OGD）对小鼠海马神经元细胞（HT22）线粒体的影响及红景天苷在该模型中的保护作用。
　　实验方法：
　　（1）各实验组的设立：通过对小鼠海马神经元细胞HT22给予氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation，OGD）处理，建造脑缺血疾病的细胞模型，并将其作为OGD组；将正常培养的HT22细胞作为对照组；将预处理红景天苷1h后，再给予OGD处理组作为红景天苷给药组；
　　（2）MTT实验：采用MTT法分别检测对照组、OGD组、红景天苷给药组的细胞存活率；
　　（3）Western blot实验：OGD造模完成后收集细胞，提取细胞蛋白。采用Western blot法，分别检测对照组、OGD组、红景天苷给药组相关蛋白水平（p-Erk、p-mTOR、MFN2、LC3等）的表达；并采用试剂盒分离、提取各处理组的线粒体蛋白，进行Western blot实验，进一步分析上述诸蛋白的表达；
　　（4）线粒体Mito-tracker染色、细胞免疫荧光实验：利用Mito-tracker标记线粒体，在共聚焦显微镜下观察对照组、OGD组、红景天苷给药组中线粒体形态、数量的改变；采用细胞免疫荧光实验，分析各处理组中线粒体自噬的改变。
　　实验结果：
　　（1）与对照组相比，OGD处理后，神经元存活率明显下降。而红景天苷给药组，可提高OGD神经元的存活率。同时，在OGD处理下，ERK、mTOR信号通路被抑制，自噬相关蛋白LC3II/LC3I表达明显增加，P62表达显著降低，表明细胞自噬的发生。
　　（2）OGD组中线粒体形态明显碎片化改变，线粒体外膜融合相关蛋白MFN2表达下调，线粒体分裂蛋白MFF表达上调，表明该条件下线粒体融合减少、分裂增多。且细胞免疫荧光实验和线粒体蛋白的western blot结果都表明，OGD处理后，发生了线粒体自噬。
　　（3）红景天苷通过招募胞浆中的mTOR蛋白转位到线粒体，激活mTOR信号通路抑制线粒体自噬，改善线粒体动力学紊乱，发挥保护作用。
　　结论：在小鼠海马神经元细胞HT22中，OGD介导了ERK-mTOR信号通路调控的线粒体自噬，并引起线粒体碎片化和线粒体动力学紊乱，导致细胞存活率下降；而红景天苷可提高OGD神经元的存活率，恢复线粒体形态并可激活mTOR信号通路抑制线粒体自噬来发挥保护作用。