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目的:建立优化的金钗石斛随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增条件,获得其DNA指纹图谱,分析DNA指纹图谱用于鉴别赤水金钗石斛及其它石斛品种。 方法:(1)分别应用植物DNA(小量)抽提试剂盒法、CTAB法及改良CTAB法提取石斛的基因组DNA。(2)设置模板DNA、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTPs、随机引物的浓度梯度,建立RAPD优化体系。(3)在RAPD优化条件基础上,从72个随机引物中筛选出能稳定扩增的引物,对12株药用石斛DNA模板进行RAPD扩增,获得其DNA指纹图谱,并构建UPGMA聚类图。(4)进而在相同实验条件下对50株赤水金钗石斛进行扩增,观察实验的可靠性、稳定性。
结果:(1)改良CTAB法提取的石斛基因组DNA分子量约23kb,电泳条带无拖尾,紫外检测OD260/OD280比值是1.72~1.93,较另外两种方法的OD260/OD280比值高(P<0.01)。(2)应用优化后的RAPD反应体系,从72个随机引物中筛选出8个能稳定扩增的随机引物(S11、S33、S48、S51、S65、S70、S71、S90),用于样本石斛基因组DNA的PCR扩增,共获得8张石斛DNA指纹图谱。(3)其中S90扩增的DNA指纹图谱中,3株金钗石斛在500bp处,均扩增出一个相同的条带,其它品种石斛未扩增出此条带。再扩大样本对50株赤水金钗石斛用S90进行PCR扩增,发现在500bp处均有相同条带。(4)聚类分析可知,在遗传距离为0.4处,可以将12株石斛分为5个聚类群,其中3株金钗石斛品种间遗传距离较近。
结论:用改良CTAB法提取的石斛基因组DNA比其它方法好;优化后的RAPD方法,可用于石斛品种的鉴别;用S90对赤水金钗石斛进行扩增,在500bp均可出现一个其它品种没有的特征性条带。