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目的:在本研究中,我们将关注益肺散结丸抑制非小细胞肺癌（NSCLC）顺铂耐药的作用,以及探讨其抑制NSCLC顺铂耐药的潜在分子机制。方法:第一部分:（1）运用逐步递增的顺铂浓度,间歇作用体外诱导法构建NSCLC顺铂耐药细胞系,为后续实验研究提供优质的生物细胞资源。（2）益肺散结丸成年SD大鼠连续灌胃7天,然后进行麻醉后腹主动脉取血,进一步提取益肺散结丸SD大鼠的含药血清。（3）药物敏感性实验分析益肺散结丸含药血清协同作用下,顺铂在NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞中的半数抑制浓度(IC50)。（4）通过流式细胞术,检测益肺散结丸含药血清联合顺铂对NSCLC细胞及其耐药细胞凋亡情况的影响。（5）采用western blot检测益肺散结丸含药血清联合顺铂对凋亡相关蛋白的作用。（6）应用裸鼠皮下异种移植瘤模型进一步研究益肺散结丸联合顺铂对NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞裸鼠皮下成瘤的作用。第二部分:（1）运用全基因组测序的方法检测A549及其顺铂耐药细胞A549DDP的差异表达基因。（2）RT-PCR验证差异最大的6个基因（上调3个,下调3个）,并筛选益肺散结丸可能的作用靶点。（3）RT-PCR和Western blot验证FMNL1在A549及其顺铂耐药细胞A549DDP细胞中的表达水平。（4）Genecard分析及免疫荧光实验研究FMNL1蛋白在细胞内的亚定位。（5）采用慢病毒转染技术建立稳定过表达或敲低FMNL1的NSCLC细胞株。（6）采用药物敏感性实验分析FMNL1对NSCLC细胞顺铂敏感性的影响。（7）细胞平板克隆形成实验研究FMNL1对NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞平板克隆形成能力的影响。（8）细胞凋亡实验检测FMNL1对NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞在无或有顺铂作用下的凋亡情况的影响。（9）采用Co-IP银染及蛋白质谱筛选细胞内与FMNL1相关作用的蛋白,运用免疫共沉淀（IP）及免疫荧光实验进一步研究FMNL1在细胞浆中与其下游靶蛋白的相互作用。（10）Western blot实验进一步研究FMNL1蛋白对其相互作用蛋白TRAP1的蛋白水平的影响。（11）RT-PCR及western blot研究益肺散结丸含药血清对NSCLC顺铂耐药细胞中FMNL1/TRAP1的m RNA和蛋白水平的作用。第三部分:（1）收集III期NSCLC术后予顺铂辅助化疗的病例107例,并构建组织芯片。（2）采用免疫组织化学染色检测107例NSCLC组织中FMNL1蛋白的表达情况。（3）采用卡方检验、Pearson卡方检验或Fisher精确概率法分析FMNL1的表达水平与临床资料（包括患者的年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤TN分期以及生存状态）之间的联系,并采用Cox回归模型进行单因素和多因素分析。（4）采用Kaplan-Meier法分析FMNL1蛋白表达与患者总生存率之间的关系,并采用Log-rank test对不同生存曲线进行比较。成果:第一部分:（1）采用逐步递增顺铂浓度和间歇作用体外诱导法建立了NSCLC顺铂耐药细胞系A549DDP和PC9DDP,显微镜下观察细胞形态,发现A549和PC9顺铂耐药后细胞形态由椭圆形变为细长的梭型;药物敏感性实验结果显示A549DDP和PC9DDP细胞的耐药指数均在10左右。这提示我们成功构建了NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP和PC9DDP。NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP和PC9DDP的成功建立,为我们后续进一步研究益肺散结丸抑制NSCLC顺铂耐药的作用及其机制提供了优质的生物细胞资源。（2）通过药物敏感性实验,我们发现益肺散结丸含药血清可降低A549、PC9、A549DDP、PC9DDP细胞顺铂IC50值,并且呈益肺散结丸含药血清浓度依赖性,即随着益肺散结丸含药血清浓度的增加,顺铂的药物IC50降低更加明显。这表明益肺散结丸含药血清可增强NSCLC细胞A549和PC9对顺铂的敏感性,抑制其耐药细胞A549DDP和PC9DDP的顺铂耐药性。（3）应用Annexin-V/PI细胞凋亡试剂盒进行细胞凋亡分析实验,发现益肺散结丸含药血清可引起NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞的凋亡,但其作用不如顺铂促进细胞凋亡的作用明显;但益肺散结丸含药血清联合顺铂可明显增强顺铂促进NSCLC细胞及其耐药细胞凋亡的作用。（4）Western blot检测凋亡相关蛋白,发现在NSCLC细胞A549及其耐药细胞A549DDP中,益肺散结丸和顺铂均可以抑制Caspase-3、Bcl-2的表达,同时上调Bax的表达,而且益肺散结丸联合顺铂的作用更为明显。（5）在裸鼠异种移植瘤模型中,发现益肺散结丸可抑制NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞皮下成瘤,控制细胞皮下成瘤的瘤积和瘤重,但其抑制作用与顺铂的抑制作用相比明显较弱;然而,益肺散结丸联合顺铂可协同抑制NSCLC细胞及其耐药细胞的皮下成瘤的能力。另外,我们还发现益肺散结丸对裸鼠的体重无明显影响,并可缓解顺铂对裸鼠体重的减轻作用。这提示我们益肺散结丸联合顺铂可以起到增效减毒的作用。第二部分:（1）为进一步研究NSCLC顺铂耐药的的分子机制及益肺散结丸抑制NSCLC顺铂耐药的作用机制,我们通过全基因组高通量测序及生物信息学深入分析NSCLC细胞A549及其顺铂耐药细胞A549DDP在基因转录组上的差异。我们发现FMNL1等基因在NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP中存在异常的高表达状态。（2）通过RT-PCR实验,我们进一步对差异倍数最大的6个基因（上调3个,下调3个）进行实验验证,发现益肺散结丸含药血清对FMNL1的m RNA水平有一定的抑制作用,而对其他差异基因无明显作用或基本无影响。因此,我们接下来主要关注FMNL1在NSCLC顺铂耐药中的作用,以及益肺散结丸对FMNL1及其下游信号分子的影响。（3）RT-PCR检测FMNL1在A549细胞及其顺铂耐药细胞A549DDP中的m RNA水平,发现FMNL1在A549DDP的m RNA水平明显高于A549细胞;western blot检测FMNL1的蛋白水平,发现FMNL1在A549DDP的蛋白质水平亦明显高于A549细胞。（4）为了进一步研究FMNL1在NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞中的亚定位,我们首先在Gene Cards在线分析网站上预测FMNL1可能主要定位于细胞的胞浆中;通过免疫荧光实验,我们进一步证实了FMNL1在NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞中确实主要定位于细胞的胞浆部分。（5）采用慢病毒转染技术建立稳定过表达或敲低FMNL1的细胞株,并通过RT-PCR和western blot验证FMNL1的m RNA和蛋白水平,发现成功构建了稳定过表达FMNL1的细胞A549-FMNL1、PC9-FMNL1及其对照组细胞A549-LV105、PC9-LV105;稳定敲低FMNL1的细胞A549DDP-sh6、A549DDP-sh7、PC9DDP-sh6、PC9DDP-sh7及其对照组细胞A549DDP-sh C、PC9DDP-sh C。（6）药物敏感性实验发现过表达FMNL1可降低NSCLC细胞对顺铂的敏感性,促进顺铂耐药;而敲低FMNL1可增强NSCLC顺铂耐药细胞对顺铂敏感性,逆转顺铂的耐药性。（7）细胞平板克隆形成实验发现过表达FMNL1可增强NSCLC细胞平板克隆形成能力,而敲低FMNL1可减弱NSCLC顺铂耐药细胞平板克隆形成能力。（8）细胞凋亡实验发现敲低FMNL1可增强NSCLC顺铂耐药细胞株对顺铂敏感性,促进细胞凋亡,逆转其顺铂耐药性;而过表达FMNL1可降低NSCLC细胞对顺铂敏感性,抑制细胞凋亡,促进顺铂耐药。（9）为了进一步研究FMNL1抑制细胞凋亡的具体分子机制,我们应用Co-IP银染及质谱分析实验,在过表达FMNL1的A549细胞中成功筛选到FMNL1的相互作用蛋白TRAP1;我们进一步应用IP实验证实在NSCLC细胞中FMNL1与TRAP1蛋白在细胞内存在相互作用。另外,细胞免激光共聚焦结果也显示FMNL1与TRAP1在NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP的细胞浆中存在共定位。（10）通过western blot实验,我们发现在NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP中,敲低FMNL1后,TRAP1的表达水平随之下调;而在NSCLC细胞系A549中,过表达FMNL1后,TRAP1的表达水平亦随之上调;这表明TRAP1是FMNL1的下游效应分子。另外我们还发现,敲低FMNL1后TRAP1蛋白的半衰期有所缩短。这提示我们FMNL1可在细胞内稳定TRAP1蛋白,维持TRAP1的蛋白水平。（11）RT-PCR实验结果显示,与对照组相比,益肺散结丸含药血清可明显抑制NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP中FMNL1的m RNA水平,并呈现出益肺散结丸含药血清浓度依赖性;在NSCLC顺铂耐药细胞PC9DDP中,也发现了相似的结果。另外,益肺散结丸含药血清可明显抑制NSCLC顺铂耐药细胞A549DDP中TRAP1的m RNA水平,并呈现出益肺散结丸含药血清浓度的依赖性;在NSCLC顺铂耐药细胞PC9DDP中,也发现了相似的结果。进一步的Western Blot实验发现,益肺散结丸含药血清可明显抑制FMNL1、TRAP1的蛋白表达水平;在顺铂耐药细胞PC9DDP中,也发现了相似的结果。以上实验结果提示我们益肺散结丸可能通过抑制FMNL1/TRAP1的m RNA和蛋白表达水平,增强NSCLC细胞对顺铂的敏感性,进而抑制NSCLC细胞顺铂耐药。第三部分:（1）为进一步明确FMNL1蛋白在临床上对NSCLC顺铂敏感性的影响,我们在中山大学附属肿瘤医院收集了107例III期NSCLC术后应用顺铂辅助化疗患者的肺癌组织标本,并构建了NSCLC组织芯片。采用免疫组织化学染色,初步探讨FMNL1蛋白在NSCLC中的表达水平并分析其临床病理学意义。我们用免疫组化染色检测了91.6%（98/107）NSCLC样本中FMNL1的表达情况,其中有9例标本有脱片或者是肿瘤细胞太少（每例标本少于300个）,因而没有被纳入我们的数据分析中。（2）纳入分析的98例III期NSCLC标本中,有61例标本存在FMNL1的高表达,在III期NSCLC中占62.2%（61/98）。同时,我们发现FMNL1的蛋白表达水平与患者的年龄、性别、原发肿瘤T和淋巴结转移N分期等无明显相关性。另外,在比较FMNL1与肺癌病理类型的相关性时,我们发现FMNL1在肺腺癌中的表达高于鳞状细胞癌（P<0.001）,并且FMNL1的表达水平与NSCLC患者的生存状态相关。（3）根据Kaplan-Meier生存分析,并用log-rank检验比较III期NSCLC术后予顺铂辅助化疗的患者存活时间差异,发现FMNL1异常高表达的NSCLC患者其总生存率（0S）明显低于那些FMNL1表达水平低的患者。结论:益肺散结丸联合顺铂可协同抑制NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞的活力和细胞增殖,促进细胞凋亡,并抑制NSCLC细胞及其顺铂耐药细胞的裸鼠皮下成瘤的瘤积和瘤重。益肺散结丸抑制FMNL1/TRAP1的m RNA和蛋白水平,可能是其抑制非小细胞肺癌顺铂耐药的主要作用机制。FMNL1的异常高表达促进了NSCLC顺铂耐药进展,并且预示着预后不良,FMNL1可能作为NSCLC患者行顺铂辅助化疗治疗效果的预测指标,而靶向抑制FMNL1,可能提高NSCLC的治疗效果。